Трудосберегающий и повторяемый сенсорный сигнализирующего мутантного протокола для изучения тигморогенеза модельного завода Arabidopsis thaliana
Summary
Нежная сенсорная погрузочная машина построена из человеческих щетк для волос, роботизированных рук и контроллера. Волосы щетки управляются роботизированные руки, установленные на машине и периодически двигаться применять сенсорную силу на растениях. Сила машинных прикосновений волос сравнима с мощи прикосновений, применяемых вручную.
Abstract
Растения реагируют как на внутриклеточные, так и на внеклеточные механические стимуляции (или сигналы силы) и развивают специальные морфологические изменения, называемые тигмоорфогенезом. В последние десятилетия было выявлено и зарегистрировано несколько сигнальных компонентов, причастных к механотрансдукции (например, ионные белки и кальцийи и ферменты биосинтеза жасмоновой кислоты). Тем не менее, относительно медленные темпы исследований в изучении силы сигнализации или thigmomorphogenesis в значительной степени связано с двумя причинами: требование к трудоемким человека ручной манипуляции сенсорный индукции thigmomorphogenesis и ошибка силы силы связанных с рукоприковки людей. Для повышения эффективности внешней нагрузки на растительный организм была построена автоматическая сенсорная погрузочная машина. Этот роботизированный рукопожатный щетки для волос обеспечивают трудосберегающее и легко повторяемое моделирование сенсорной силы, неограниченное количество раундов сенсорного повторения и регулируемую силу касания. Эта машина для погрузки прикосновения волос может быть использована как для крупномасштабного скрининга сенсорных сигнальных мутантов, так и для исследования феномики растительного тигмоорфогенеза. Кроме того, сенсорные материалы, такие как человеческие волосы, могут быть заменены другими натуральными материалами, такими как волосы животных, шелковые нити и хлопковые волокна. Автоматизированное движущееся оружие на машине может быть оснащено сопла миографами и воздуходувками, чтобы имитировать природные силы капель дождя и ветра, соответственно. Используя эту автоматическую машину погрузки с прикосновением волос в сочетании с ручным прикосновением ватного тампона, мы исследовали сенсорную реакцию двух силовых сигнальных мутантов, MAP KINASE KINASE 1 (MKK1) и MKK2 . Фаромы сенсорной силы загружены растениями дикого типа и двумя мутантами были оценены статистически. Они продемонстрировали значительные различия в сенсорной реакции.
Introduction
Завод thigmomorphogenesis это термин, который был придуман Jaffe, MJ в 1973году 1. Это тропизм растений, но отличается от известного фототропизма или гравитропизма, вызванного стимулами солнечного света или гравитации2,3. Он описывает фенотипические изменения, связанные с периодическими механическими стимуляциями, которыечасто наблюдались ботаниками в прежние времена 4,5. Капли дождя, ветер, растение, животное и человеческие прикосновения, даже укусы животных, все считаются различными типами механо-стимулов, которые вызывают силу сигнализации в растениях4,5. Характеристики растений thigmomorphogenesis включают задержку болтов, короткий стебель, меньше розетки / листьев размера в травянистых растений, и толще стебля в древесных растений6,7,8. Это в отличие от тигмонастики или тигмотропной реакции часто встречаются в Mimosa завода или других механо чувствительных виноградных лоз, где эти быстрые сенсорные реакции легче наблюдаться1,9,10. Thigmomorphogenesis, с другой стороны, относительно трудно наблюдаться из-за его медленной реакции роста. Thigmomorphogenesis обычно наблюдается после недели или даже лет непрерывной стимуляции силы загрузки. Эта уникальная природа реакции прикасание растений затрудняет выполнение переднего генетического экрана с помощью человеческой стимуляции прикосновения руки, чтобы изолировать сенсорную силу, сигнализирующую устойчивых мутантов в надежной манере.
Чтобы выяснить путь трансдукции сигнала силы и молекулярные механизмы,лежащие в основе тигмолорфогенеза 6,11, молекулярные и клеточные биологические эксперименты были выполнены в последние6, 12,13,14. Эти исследования показали, что рецепторы сигнала силы растения в основном состоят из механочувствительных ионных каналов (MSC) и привязываемых комплексов MSC, составленных многомерными комплексами мембранно-охватывающих белков11,14 , 15. Цитоплазмический Ca2 “переходный шип генерируется в течение нескольких секунд после первоначального прикосновения. Ветер-, дождь, или gravi-стимуляции может взаимодействовать с датчиками кальция вниз по течению, чтобы преобразовать сигналы силы к ядерным событиям14,16,17,18. В дополнение к молекулярным и клеточным исследованиям, передний генетический экран с ручным прикосновением пальца растений обнаружил, что фитогормоны и вторичные метаболиты участвуют в последующей сенсорной индуцируемой (TCH) экспрессии гена после сенсорная загрузка13,19. Для примера, aos и opr320 мутантов были определены до сих пор от генетических исследований. Однако основной проблемой, связанной с применением передовой генетики при изучении тигмолорфогенеза, по-прежнему является интенсивная труд, необходимая для количественной оценки уровня сенсорной реакции и прикосновения к большой популяции генетически мутировавших отдельных растений. Трудоемкая проблема также сохраняется в руке касаясь на основе мутанта экран14,20. Например, чтобы выполнить один раунд сенсорной стимуляции, человек должен коснуться 30-60 раз (одно касание в секунду) на отдельном заводе. Для того, чтобы иметь достаточное количество растений для статистического анализа фенотипа, 20-50 отдельных растений одного генотипа, как правило, необходимы для процесса загрузки сенсорной силы. Этот режим загрузки сенсорной силы означает, что человек должен повторно выполнять 600-3000 касаний по одному генотипу выбора. Этот тип прикосновения обычно необходимо повторять от 3 до 5 раундов в день, что составляет примерно 1800-15000 палец или ватный тампон касается в день на генотип растений. Хорошо обученный человек, как правило, требуется для поддержания силы и силы нескольких касаний в пределах желательного диапазона в течение многих раундов повторения в день, чтобы избежать больших изменений в силе и силе. Как хорошо известно, что тигмоорфогенез является сатурируемым и дозозависимым процессом6,21, сила касания / сила становится критически важным для успеха в запуске сенсорной реакции растения.
Для удаления зависящей от человека сенсорной нагрузки и поддержания механического применения в приемлемом диапазоне ошибок14,мы поэтому разработали автоматическую сенсорную загрузку для замены ручных касаний. Машина имеет 4 движущихся оружия построен, каждый из которых оснащен одной человеческой щеткой для волос. Эта версия называется Модель K1, чтобы указать его особенность человеческого волоса сенсорной нагрузки. Если 4 генотипа измеряются количественно для их тигмоорфогенеза или сенсорной реакции под одной машиной, 40-48 человек на генотип может быть измерено. Каждый раунд сенсорного повторения (менее 60 раз касания на каждое растение) длится менее 5 минут с помощью движущейся скорости регулируемой роботизированной руки. Таким образом, растения на сенсорной машине Model K1 могут быть механически стимулированы в течение нескольких раундов в день либо с постоянной загрузкой сенсорной силы, либо с различными уровнями прочности, как первоначально запрограммировано.
Arabidopsis thaliana, модель растительного организма, поэтому был выбран в качестве целевого вида растений для тестирования полностью автоматического применения машины погрузки волос сенсорной силы. Потому что Есть несколько крупных семенных банков для извлечения различных зародышевых мутантов и размер цветения, Arabidopsis хорошо подходит для пространства, доступного в рост полке установлен с моделью K1 сенсорный аппарат.
Автоматическая сенсорная машина Model K1 состоит из трех основных компонентов: (1) металлическая стойка H-формы, состоящая из двух линейных приводов, (2) роботизированные металлические руки, оснащенные щетками для волос, и (3) контроллер. Для настраиваемой модели K1 сенсорной машины, каждый модуль X / Y оси состоит из одного пояса управляемых направляющий-железнодорожный, два слайд-блоков (красный) и один 57 ступенчатый двигатель (предварительно установлены и демонтированы) (Рисунок 1A,B). Верхний горизонтальный привод позволяет роботизированной металлической руке двигаться влево и вправо горизонтально, нижний вертикальный пояс-управляемый линейный привод позволяет роботизированной металлической руке двигаться вверх и вниз вертикально (Рисунок 1B, Рисунок 2A ). Четыре разъемных роботизированных оружия были установлены на вертикальном приводе(рисунок 1C, рисунок 2B). Четыре человеческие щетки для волос были связаны с четырьмя роботизированными руками, соответственно(рисунок 1C, рисунок 2B). Все механические детали для построения модели K1 сенсорный аппарат в смелый шрифт ниже отмечены на рисунке 1C (также см. таблицу материалов).
Protocol
Representative Results
Discussion
Thigmomorphogenesis является сложной реакции роста растений на механические возмущения, которая включает в себя сеть клеточной сигнализации и действия фитогормонов. Это следствие адаптивной эволюции растений, чтобы выжить в нежелательных условиях окружающей среды25,<sup class="xr…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано следующими грантами: 31370315, 31570187, 31870231 (Национальный научный фонд Китая), 16100318, 661613, 16101114, 16103615, 16103817, AoE/M-403/16 RGC (Гонконг). Авторы хотели бы поблагодарить Ju Feng Точности и автоматизации технологии Limited (Шэньчжэнь, Китай) за их предложение нескольких схем, показанных на рисунке 1.
Авторы также хотели бы поблагодарить С. К. Ченга и В. К. Ли за их вклад в развитие сенсорной погрузочной машины.
Materials
| 4 hair brushes | customized | ||
| 4 robot arms with one holder | customized | 1000 mm length holder and 560 mm length robot arm | |
| 57 stepper motor | 57HS22-A | ||
| All purpose potting soil | Plantmate, Hong Kong | ||
| Arabidopsis plant seeds | Arabidopsis Biological Resource Centers, Columbus, OH | For arabidopsis seed purchase | |
| BIO-MIX potting substratum | Jiffy Products International BV, the Netherlands | 1000682050 | Two soils were mixed together to grow Arabidopsis. The ratio of All purpos potting soil and BIO-MIX is 1:2 |
| IL 1700 research radiometer | International Light, Newburyport, MA | The light intensity of both full-wavelength and photosynthetic active radiation can be measured. | |
| ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | Free downloaded software | |
| Ju Feng Precision and Automation Technology Limited | Shenzhen, China | For belt-driven linear actuators and other mechanical modules purchase | |
| Junction plate of the slide block | To fix the Y guide-rail module or Y auxiliary girder onto backs of slide blocks | ||
| Junction plate of the X axis module | customized | To connect the X guide-rail module and X auxiliary girder | |
| Slide block | |||
| WDT4045 X axis guide-rail module | 843 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks and one 57 stepper motor | |
| WDT4045 Y axis guide-rail module | 1038 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks and one 57 stepper motor | |
| X axis auxiliary girder | 843 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks | |
| Y axis auxiliary girder | 1038 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks |
Referências
- Jaffe, M. J. Thigmomorphogenesis: the response of plant growth and development to mechanical stimulation with special reference to Bryonia dioica. Planta. 114, 143-157 (1973).
- Vandenbrink, J. P., Kiss, J. Z., Herranz, R., Medina, F. J. Light and gravity signals synergize in modulating plant development. Frontiers in Plant Science. 5, 563 (2014).
- Hashiguchi, Y., Tasaka, M., Morita, M. T. Mechanism of higher plant gravity sensing. American Journal of Botany. 100, 91-100 (2013).
- Salisbury, F. B. . The Flowering Process. , (1963).
- Darwin, C. . The Power of Movement in Plants. , (1881).
- Chehab, E. W., Eich, E., Braam, J. Thigmomorphogenesis: a complex plant response to mechano-stimulation. Journal of Experimental Botany. 60, 43-56 (2008).
- Telewski, F. W., Jaffe, M. J. Thigmomorphogenesis: anatomical, morphological and mechanical analysis of genetically different sibs of Pinus taeda in response to mechanical perturbation. Physiologia Plantarum. 66, 219-226 (1986).
- Vogel, M. Automatic precision measurements of radial increment in a mature spruce stand and interpretation variants of short term changes in increment values. Allgemeine Forst-und Jagdzeitung. , (1994).
- Braam, J. In touch: plant responses to mechanical stimuli. New Phytologist. 165, 373-389 (2005).
- Jaffe, M. J., Leopold, A. C., Staples, R. C. Thigmo responses in plants and fungi. American Journal of Botany. 89, 375-382 (2002).
- Telewski, F. W. A unified hypothesis of mechanoperception in plants. American Journal of Botany. 93, 1466-1476 (2006).
- Gutiérrez, R. A., Ewing, R. M., Cherry, J. M., Green, P. J. Identification of unstable transcripts in Arabidopsis by cDNA microarray analysis: rapid decay is associated with a group of touch-and specific clock-controlled genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11513-11518 (2002).
- Lee, D., Polisensky, D. H., Braam, J. Genome-wide identification of touch-and darkness-regulated Arabidopsis genes: a focus on calmodulin-like and XTH genes. New Phytologist. 165, 429-444 (2005).
- Wang, K., et al. Quantitative and functional posttranslational modification proteomics reveals that TREPH1 plays a role in plant touch-delayed bolting. Proceedings of the National Academy of Sciences United States of America. 115, 10265-10274 (2018).
- Hamilton, E. S., Schlegel, A. M., Haswell, E. S. United in diversity: mechanosensitive ion channels in plants. Annual Review of Plant Biology. 66, 113-137 (2015).
- Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium. Nature. 352, 524 (1991).
- Toyota, M., Furuichi, T., Tatsumi, H., Sokabe, M. Cytoplasmic calcium increases in response to changes in the gravity vector in hypocotyls and petioles of Arabidopsis seedlings. Plant Physiology. 146, 505-514 (2008).
- Knight, M. R., Smith, S. M., Trewavas, A. J. Wind-induced plant motion immediately increases cytosolic calcium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 4967-4971 (1992).
- Braam, J., Davis, R. W. Rain-, wind-, and touch-induced expression of calmodulin and calmodulin-related genes in Arabidopsis. Cell. 60, 357-364 (1990).
- Chehab, E. W., Yao, C., Henderson, Z., Kim, S., Braam, J. Arabidopsis touch-induced morphogenesis is jasmonate mediated and protects against pests. Current Biology. 22, 701-706 (2012).
- Telewski, F. W., Pruyn, M. L. Thigmomorphogenesis: a dose response to flexing in Ulmus americana seedlings. Tree Physiology. 18, 65-68 (1998).
- De Vylder, J., Vandenbussche, F. J., Hu, Y., Philips, W., Van Der Straeten, D. Rosette tracker: an open source image analysis tool for automatic quantification of genotype effects. Plant Physiology. , (2012).
- Clark, T., Bradburn, M., Love, S., Altman, D. Survival analysis part I: basic concepts and first analyses. British Journal of Cancer. 89, 232 (2003).
- Bradburn, M. J., Clark, T. G., Love, S., Altman, D. Survival analysis part II: multivariate data analysis–an introduction to concepts and methods. British Journal of Cancer. 89, 431 (2003).
- Jaffe, M., Forbes, S. Thigmomorphogenesis: the effect of mechanical perturbation on plants. Plant Growth Regulation. 12, 313-324 (1993).
- Kutschera, U., Niklas, K. J. Evolutionary plant physiology: Charles Darwin’s forgotten synthesis. Naturwissenschaften. 96, 1339 (2009).
