Inducible, सेल प्रकार- Arabidopsis में विशेष अभिव्यक्ति lhgr के माध्यम से thaliana-मध्यस्थता ट्रांस-सक्रियण
Summary
यहाँ हम ट्रांसजेनिक अरेबिडोप्सिस थालियाना लाइनों के एक सेट के उत्पादन और अनुप्रयोग का वर्णन करते हैं, जो तीन मुख्य विभज्योतक में, ऊतक-विशिष्ट अभिव्यक्ति को सक्षम करने में समर्थ बनाता है, प्ररोह-शीर्षस्थ विभज्योतक, मूल शीर्षस्थ विभज्योतक, और कैंबीयम ।
Abstract
Inducible, ऊतक विशिष्ट अभिव्यक्ति एक महत्वपूर्ण और शक्तिशाली करने के लिए आनुवंशिक क्षोभ के spatio-लौकिक गतिशीलता का अध्ययन उपकरण है । सिद्ध और बेंचमार्क LhGR प्रणाली के साथ लचीला और कुशल GreenGate क्लोनिंग प्रणाली का मेल (यहां जीआर-LhG4) inducible अभिव्यक्ति के लिए कहा, हम ट्रांसजेनिक Arabidopsis लाइनों का एक सेट है कि एक effector की अभिव्यक्ति ड्राइव कर सकते है उत्पंन किया है तीन मुख्य संयंत्र meristems में विशिष्ट कोशिका प्रकार की एक श्रृंखला में कैसेट । यह अंत करने के लिए, हम पहले से विकसित जीआर-LhG4 प्रणाली एक chimeric ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर और एक सजात पॉप प्रकार अभिव्यक्ति के स्तर की एक विस्तृत श्रृंखला पर तंग नियंत्रण सुनिश्चित करने के प्रमोटर के आधार पर चुना । इसके अलावा, जहां सिंथेटिक ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर सक्रिय है अभिव्यक्ति डोमेन विज़ुअलाइज़ करने के लिए, एक एर-स्थानीयकृत mTurquoise2 फ्लोरोसेंट रिपोर्टर नियंत्रण में pOp4 या pOp6 प्रमोटर ड्राइवर लाइनों में एंकोडेड है । यहाँ, हम एक ड्राइवर या effector लाइन उत्पन्न करने के लिए आवश्यक कदम का वर्णन और कैसे सेल प्रकार विशिष्ट अभिव्यक्ति प्रेरित किया जा सकता है और गोली मार शीर्षस्थ विभज्योतक, रूट शीर्षस्थ विभज्योतक और arabidopsisके केंबियम में पालन करने के लिए प्रदर्शन. कई या सभी ड्राइवर लाइनों का उपयोग करके, एक या कई कारकों (effectors) सिंथेटिक पॉप प्रमोटर के नियंत्रण में व्यक्त करने के संदर्भ विशिष्ट प्रभाव तेजी से मूल्यांकन किया जा सकता, उदाहरण के लिए एक पार के F1 पौधों में एक effectors और कई के बीच ड्राइवर रेखाएं । इस दृष्टिकोण VND7 की अस्थानिक अभिव्यक्ति, एक एनएसी प्रतिलेखन कारक एक सेल स्वायत्त तरीके से अस्थानिक माध्यमिक सेल दीवार बयान उत्प्रेरण में सक्षम द्वारा उदाहरण है ।
Introduction
Postgenomic युग में जीव विज्ञान में एक प्रमुख सीमा एक दिया कारक या आनुवंशिक क्षोभ की संदर्भ विशिष्ट भूमिका को समझने के लिए है । इस तरह के नुकसान के रूप में संचक आनुवंशिक perturbations समारोह और लाभ के समारोह के दृष्टिकोण अक्सर केवल अनुमति जीवन के अंत बिंदु विश्लेषण-लंबी अनुकूलन प्रक्रियाओं, प्राथमिक और द्वितीयक प्रभाव के बीच भेद obfuscating । इसके अलावा, संदर्भ विशिष्ट कार्यों नकाबपोश या दूर ऊतकों में बड़े पैमाने पर प्रभाव या विकास के अन्य चरणों के दौरान पतला किया जा सकता है. इसके अलावा, चरम मामलों में, घातकता किसी भी यंत्रवादी अंतर्दृष्टि को बाधित कर सकता है । आदर्श रूप में, इन मुद्दों को दरकिनार करने के लिए, एक समय में एक विशिष्ट कोशिका प्रकार के रूप में एक विशिष्ट संदर्भ के भीतर तीव्र आनुवंशिक क्षोभ के प्रभाव का विश्लेषण कर सकता है एक तरह से हल । यह प्राप्त करने के लिए, आनुवंशिक उपकरण inducible के लिए, सेल प्रकार विशिष्ट अभिव्यक्ति1आवश्यक हैं । एक दिए गए effector के लिए एक प्रतिक्रिया की spatiotemporal गतिशीलता के तेजी से मूल्यांकन के लिए एक संसाधन प्रदान करने के लिए, हम जीआर-LhG4 प्रणाली के सिद्ध प्रभावकारिता के साथ GreenGate2 प्रणाली द्वारा प्रदान की क्लोनिंग की आसानी संयुक्त है3, 4,5,6. हम चिंराट ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर LhG4 अभिव्यक्त लाइनों का एक सेट उत्पंन किया है चूहा corticoid रिसेप्टर (जीआर)7 अच्छी तरह से विशेषता सेल प्रकार विशिष्ट प्रमोटरों के नियंत्रण के अंतर्गत के लिगामेंट बाध्यकारी डोमेन के लिए संगलित त । आराम की स्थिति में, प्रतिलेखन कारक नाभिक के बाहर रहता है, के रूप में जीआर डोमेन cytosolic HSP90 से बंधे है । सिंथेटिक लिडऔर dexamethasone (Dex) के अलावा, परमाणु स्थानांतरण प्रेरित है और LhG4 अभिव्यक्ति कैसेट के प्रतिलेखन एक सजात सिंथेटिक पॉप-प्रकार के प्रमोटर के नियंत्रण में, जैसे एक mTurquoise2 रिपोर्टर के रूप में मध्यस्थता करेगा शामिल करने के बाद अभिव्यक्ति डोमेन विज़ुअलाइज़ करने के लिए ड्रायवर पंक्तियाँ में सम्मिलित किया गया है । इस प्रकार, चालक लाइनों तकनीकी रूप से भी एक effector कैसेट होते हैं । एक के साथ एक effector कैसेट ले जाने की रेखा के साथ चालक लाइनों के एक सेट के पार, उदाहरण के लिए, एक ही पॉप के नियंत्रण में ब्याज की एक जीन प्रकार प्रमोटर इस प्रकार effector अभिव्यक्ति के तीव्र या दीर्घकालिक परिणामों के तेजी से मूल्यांकन की अनुमति देता है सेल प्रकार की एक विस्तृत श्रृंखला में ।
यहां, हम एक के लिए ड्राइवर और effector लाइनों उत्पंन और कैसे सेल प्रकार विशिष्ट अभिव्यक्ति प्रेरित किया जा सकता है और गोली मार शीर्षस्थ विभज्योतक, रूट शीर्षस्थ विभज्योतक और केंबियम में पालन करने के लिए आवश्यक प्रक्रियाओं का वर्णन प्रोटोकॉल प्रदान अरैडिडोप्सिस । इस दृष्टिकोण के कौशल और विशिष्टता का वर्णन करने के लिए, हम अच्छी तरह से ज्ञात ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर VND7 जो दारू की तरह माध्यमिक कोशिका दीवार thickenings ectopically9ड्राइविंग में सक्षम है का उपयोग । Pscr10,11 चालक लाइन और pOp6 के बीच एक क्रॉस से F1 इलाज : VND7 effector लाइन arabidopsis स्टेम के स्टार्च म्यान कोशिकाओं में अस्थानिक जाइलम की तरह कोशिकाओं के गठन की ओर जाता है.
चालक और effector अभिव्यक्ति plasmids के निर्माण के लिए आवश्यक बड़े डीएनए विधानसभाओं के उत्पादन की सुविधा के लिए, हम तेजी से और कुशल GreenGate क्लोनिंग विधि2का इस्तेमाल किया । GreenGate क्लोनिंग प्रकार द्वितीय एस इको31i या उसके isoschizomer Bsaमैं2के रूप में प्रतिबंध एंजाइमों पर आधारित है । इन एंजाइमों उनकी असममित मांयता साइटों के अनुप्रवाह में कटौती आधार संरचना के साथ overhangs उत्पादन । पारिस्थितिकी31i/Bsai को शामिल करके ओलिओन्यूक्लिओटाइड में प्रतिबंध साइटों और डीएनए तत्वों के लिए विशिष्ट अधिकता दृश्यों का आवंटन, मॉड्यूलर क्लोनिंग हासिल की है, बड़ी विधानसभाओं के उत्पादन की सुविधा । Greengate ढांचे में, डीएनए मॉड्यूल एक-एफ श्रेणियों में गिर अधिकता अनुक्रम कि एडेप्टर के रूप में काम करते है और उस क्रम में इकट्ठे होते है पर आधारित है । इसलिए, अपने वांछित उत्पाद बढ़ाना करने के लिए डिज़ाइन प्राइमरों चयनित मॉड्यूल2 के साथ अनुसार होना चाहिए (चित्र 1a). अगर वहां एक आंतरिक पर्यावरण31i/Bsaमैं साइट और अनुक्रम greengate प्रवेश और गंतव्य मॉड्यूल के साथ संगत नहीं है, तो आप mutagenizing बिना आगे बढ़ सकते हैं, लेकिन कम दक्षता के साथ । वैकल्पिक रूप से, साइट का उपयोग करें निर्देशित mutagenesis को हटाने केलिए पारिस्थितिकी31i/
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां, हम उत्पंन करने के लिए आवश्यक कदम का वर्णन और inducible, सेल प्रकार विशिष्ट ट्रांससक्रियण के लिए एक बहुमुखी और व्यापक toolkit लागू होते हैं । चालक लाइनों के साथ पॉप प्रमोटर के नियंत्रण में effector कैसेट ले ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हमारी प्रयोगशालाओं में कार्य जर्मन अनुसंधान प्रतिष्ठान (डीएफजी) द्वारा समर्थित है अनुदान दो 1660/6-1 (को दप) और जीआर 2104/4-1 (को टीजी) और SFB1101 (टीजी और जे यू एल) और एक यूरोपीय अनुसंधान परिषद consolidator अनुदान (PLANTSTEMS ६४७१४८) द्वारा टीजी दप ग्रांट WO 1660/2 के माध्यम से DFG की एमी Noether फैलोशिप के माध्यम से समर्थित है ।
Materials
| Ampicillin | Carl Roth GmbH + Co. KG | K029.1 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | |
| Column purification | Qiagen | QIAquick PCR Purification Kit (250) | |
| Culture chamber for imaging | Sarstedt AG & Co. KG | 1-well tissue culture chamber, on cover glass II | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4903 | |
| DMSO | Fisher Scientific, UK | D139-1 | |
| Eco31I | Thermo Fisher Scientific | FD0294 | |
| injection cannula (0.30 x 12 mm, 30 G x 1/2) | Sterican, Braun | ||
| Kanamycin | Carl Roth GmbH + Co. KG | T832.2 | |
| Leica TCS SP5 CLSM, HCX PL APO lambda blue 63x water immersion objectiv | Leica, Wetzlar, Germany | ||
| MS medium | Duchefa, Haarlem, Netherlands | M0221.0050 | |
| Nikon A1 CLSM, Apo LWD 25x 1.1 NA water immersion objective | Nikon, Minato, Tokyo, Japan | ||
| Petri dish 35/10 mm | Greiner Bio-One GmbH, Germany | 627102 | |
| Petri dish 60/150 mm | Greiner Bio-One GmbH, Germany | 628102 | |
| Petri dish 120/120/17 | Greiner Bio-One GmbH, Germany | 688102 | |
| Plant agar | Duchefa, Haarlem, Netherlands | P1001 | |
| Plasmid extraction | Qiagen | QIAprep Spin Miniprep Kit | |
| Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Razorblade | Classic, Wilkinson Sword GmbH | 7005115E | |
| Reaction tubes | Sarstedt AG & Co. KG | 72.690.001 | |
| Silwet L-77 | Kurt Obermeier GmbH & Co. KG, Bad Berleburg, Germany | ||
| Spectinomycin | AppliChem GmbH | 3834.001 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000c | |
| Sucrose | Carl Roth GmbH + Co. KG | 4621.1 | |
| Sulfadiazine | Sigma-Aldrich | S6387 | |
| Tetracycline | AppliChem GmbH | 2228.0025 | |
| T4 Ligase 5 U/µl | Thermo Fisher Scientific | EL0011 | |
| T4 Ligase 30 U/µl | Thermo Fisher Scientific | EL0013 |
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