Visualización de complejos endógenos de mitophagy in Situ en células beta pancreáticas humanas que utilizan el ensayo de ligadura de proximidad
Summary
Este protocolo describe un método para el análisis cuantitativo de la formación de complejos de proteínas mitophagy específicamente en células beta a partir de muestras de islet humanos primarios. Esta técnica permite así el análisis de la mitopagia a partir de material biológico limitado, que son cruciales en las muestras preciosas de células beta pancreáticas humanas.
Abstract
La mitopagia es una vía de control de calidad mitocondrial esencial, que es crucial para la bioenergética de células beta de islotes pancreáticos para alimentar la liberación de insulina estimulada por la glucosa. La evaluación de la mitopagia es un reto y a menudo requiere reporteros genéticos o múltiples técnicas complementarias que no se utilizan fácilmente en muestras de tejido, como islotes pancreáticos humanos primarios. Aquí demostramos un enfoque robusto para visualizar y cuantificar la formación de complejos de mitopagia endógenos clave en islotes pancreáticos humanos primarios. Utilizando la técnica de ensayo de ligadura de proximidad sensible para detectar la interacción de los reguladores de mitopagia NRDP1 y USP8, somos capaces de cuantificar específicamente la formación de complejos de mitopagia esenciales in situ. Al acoplar este enfoque a la contramancha para el factor de transcripción PDX1, podemos cuantificar los complejos de mitopagia, y los factores que pueden afectar la mitopagia, específicamente dentro de las células beta. La metodología que describimos supera la necesidad de grandes cantidades de extractos celulares necesarios para otros estudios de interacción proteína-proteína, como la inmunoprecipitación (IP) o la espectrometría de masas, y es ideal para muestras de islotes humanos preciosos generalmente no disponibles en cantidades suficientes para estos enfoques. Además, esta metodología evita la necesidad de técnicas de clasificación de flujo para purificar las células beta de una población de isletes heterogéneos para aplicaciones de proteínas aguas abajo. Por lo tanto, describimos un protocolo valioso para la visualización de la mitopagia altamente compatible para su uso en poblaciones celulares heterogéneas y limitadas.
Introduction
Las células beta pancreáticas producen la insulina necesaria para mantener la homeostasis normal de glucosa, y su fracaso resulta en el desarrollo de todas las formas de diabetes. Las células beta conservan una robusta capacidad mitocondrial para generar la energía necesaria para acoplar el metabolismo de la glucosa con la liberación de insulina. Recientemente, se ha hecho evidente que el mantenimiento de la masa mitocondrial funcional es de importancia fundamental para la función óptima de la célula beta1,2,3. Con el fin de mantener la masa mitocondrial funcional, las células beta dependen de mecanismos de control de calidad para eliminar las mitocondrias disfuncionales, dañadas o envejecidas4. Nosotros y otros hemos demostrado previamente que las células beta se basan en una forma especializada de rotación mitocondrial, llamada autofagia mitocondrial (o mitopagy), para mantener el control de calidad mitocondrial tanto en roedores como en islas humanas1, 2,5. Desafortunadamente, sin embargo, no había un método simple para detectar la mitopagia, o los componentes de mitopagia expresados endógenamente, en células beta pancreáticas humanas.
Recientemente hemos demostrado que la regulación ascendente de la mitopagia en células beta se basa en la formación de un complejo proteico que comprende las ligases E3 CLEC16A y NRDP1 y la desubiquitinasa USP81. NRDP1 y USP8 han demostrado de forma independiente afectar la mitopagia a través de la acción en el iniciador clave de mitopagy PARKIN6,7. NRDP1 se dirige a PARKIN para la ubiquitinación y degradación para desactivar la mitopagia6,y USP8 desubiquitiniza específicamente PARKIN vinculado a K6 para promover su translocación a las mitocondrias7. La tecnología de ensayo de ligadura de proximidad (PLA) hasido un avance reciente en el campo de la biología de la interacción proteica 8, permitiendo la visualización de interacciones proteicas endógenas in situ en células individuales, y no está limitada por el escaso material de la muestra. Esta metodología es particularmente tentadora para la biología de células de islotes/beta humanas, debido a la escasa de la disponibilidad de la muestra, junto a la necesidad de comprender los complejos proteicos fisiológicamente relevantes dentro de los tipos de células heterogéneas.
Utilizando el enfoque PLA, somos capaces de observar los complejos de mitopagia endógenos clave en las células beta pancreáticas primarias y las líneas celulares neuronales, y demostrar los efectos de un ambiente diabetogénico en la vía mitophagia1. En resumen, el objetivo general de este protocolo es analizar complejos específicos de proteína mitopagia en tejidos que carecen de material abundante, o donde los estudios convencionales de interacción proteica no son posibles.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí describimos un enfoque simple y eficiente para utilizar NRDP1:USP8 PLA en tejidos/células de interés para cuantificar la formación de complejos mitopagia aguas arriba. Anteriormente confirmamos la formación del complejo de mitopagia CLEC16A-NRDP1-USP8 en células beta pancreáticas por varias metodologías, incluyendo experimentos de co-inmunoprecipitación, estudios de interacción sin células, y in vitro, así como basado en células ubiquitinación, y demostró cómo este complejo impulsa el flujo mitopági…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores reconocen el apoyo de financiamiento de JDRF (CDA-2016-189 y SRA-2018-539), el Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales, Institutos Nacionales de Salud (R01-DK-108921), la familia Brehm y la familia Anthony. El Premio JDRF de Desarrollo Profesional a S.A.S. cuenta en parte con el apoyo de la Academia Danesa de la Diabetes, que cuenta con el apoyo de la Fundación Novo Nordisk.
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA 1X | Life Technologies | 25200-056 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Block solution | Homemade | Use 1X PBS, add 10 % donkey serum, and 0.3% Triton X-100 detergent. | |
| Buffer A | Homemade | To make 1L: Mix 8.8g NaCl, 1.2g Tris base, 500ul Tween-20, with 750mL ddH20. pH to 7.5 with HCl, and fill to 1L. Filter solution and store at 4C. Bring to RT before experimental use | |
| Buffer B | Homemade | To make 1L: Mix 5.84g NaCl, 4.24g Tris base, 26g Tris-HCl with 500mL ddH20. pH to 7.5, and fill to 1L. Filter solution and store a 4C. Bring to RT before experimental use | |
| Cy5-conjugated AffiniPure donkey anti-goat | Jackson Labs | 705-175-147 | |
| Detection Reagents Red | Sigma- Aldrich | DU092008-100RXN | Kit containing: ligation solution stock (5X), ligase, amplification solution stock (5X) and polymerase. |
| DuoLink PLA probe anti-mouse MINUS | Sigma- Aldrich | DU092004-100RXN | |
| DuoLink PLA probe anti-rabbit PLUS | Sigma- Aldrich | DU092002-100RXN | |
| Fetal bovine serum | |||
| Goat polyclonal anti-PDX1 (clone A17) | Santa Cruz | SC-14664 | RRID: AB_2162373 |
| HEPES (1M) | Life Technologies | 15630-080 | |
| MIN6 pancreatic cell line | Gift from D. Stoffers | Mouse insulinoma cell line, utilized for cell-based assays. | |
| Mouse monoclonal anti-USP8 antibody (clone US872) | Sigma- Aldrich | SAB200527 | |
| Pap-pen | Research Products International | 195505 | |
| Parafilm | Use to seal antibody and probe solutions on your cells to prevent evaporation when using small solution volumes. | ||
| PBT (phosphate buffered saline with triton) | Homemade | To make 50mL: 43.5mLddH2O, 5mL 10X PBS, 0.5mL 10X BSA(100mg/mL solution), 1mL 10% triton X-100 solution in ddH20) | |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline, 10X | Fisher Scientific | BP399-20 | |
| PIM(ABS) Human AB serum | Prodo Labs | PIM-ABS001GMP | |
| PIM(G) (glutamine) | Prodo Labs | PIM-G001GMP | |
| PIM(S) media | Prodo Labs | PIM-S001GMP | |
| PR619 | Apex Bio | A812 | |
| Prolong Gold antifade reagent with DAPI | Life Technologies (Molecular Probes) | P36935 | |
| Rabbit polyclonal anti-FLRF/RNF41 (Nrdp1) | Bethyl Laboratories | A300-049A | RRID: AB_2181251 |
| SH-SY5Y cells | Gift from L. Satin | Human neuroblastoma cell line, utilized for cell-based assays. | |
| Sodium Pyruvate (100X) | Life Technologies | 11360-070 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| Water for RNA work (DEPC water) | Fisher Scientific | BP361-1L |
Referências
- Pearson, G., et al. Clec16a, Nrdp1, and USP8 Form a Ubiquitin-Dependent Tripartite Complex That Regulates beta-Cell Mitophagy. Diabetes. 67 (2), 265-277 (2018).
- Soleimanpour, S. A., et al. The diabetes susceptibility gene Clec16a regulates mitophagy. Cell. 157 (7), 1577-1590 (2014).
- Kaufman, B. A., Li, C., Soleimanpour, S. A. Mitochondrial regulation of β-cell function: Maintaining the momentum for insulin release. Molecular Aspects of Medicine. , (2015).
- Hattori, N., Saiki, S., Imai, Y. Regulation by mitophagy. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 53, 147-150 (2014).
- Soleimanpour, S. A., et al. Diabetes Susceptibility Genes Pdx1 and Clec16a Function in a Pathway Regulating Mitophagy in beta-Cells. Diabetes. 64 (10), 3475-3484 (2015).
- Zhong, L., Tan, Y., Zhou, A., Yu, Q., Zhou, J. RING Finger Ubiquitin-Protein Isopeptide Ligase Nrdp1/FLRF Regulates Parkin Stability and Activity. Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 9425-9430 (2005).
- Durcan, T. M., et al. USP8 regulates mitophagy by removing K6-linked ubiquitin conjugates from parkin. The EMBO Journal. 33 (21), 2473-2491 (2014).
- Gauthier, T., Claude-Taupin, A., Delage-Mourroux, R., Boyer-Guittaut, M., Hervouet, E. Proximity Ligation In situ Assay is a Powerful Tool to Monitor Specific ATG Protein Interactions following Autophagy Induction. PLoS ONE. 10 (6), e0128701 (2015).
- Silva Xavier, D. a., G, The Cells of the Islets of Langerhans. Journal of Clinical Medicine. 7 (3), 54 (2018).
- Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. Pancreatic islet plasticity: Interspecies comparison of islet architecture and composition. Islets. 2 (3), 135-145 (2010).
- Cabrera, O., et al. The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (7), 2334 (2006).
- Brissova, M., et al. Assessment of Human Pancreatic Islet Architecture and Composition by Laser Scanning Confocal Microscopy. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (9), 1087-1097 (2005).
- Babu, D. A., Deering, T. G., Mirmira, R. G. A feat of metabolic proportions: Pdx1 orchestrates islet development and function in the maintenance of glucose homeostasis. Molecular Genetics and Metabolism. 92 (1), 43-55 (2007).
- Poitout, V., et al. Glucolipotoxicity of the pancreatic beta cell. Biochimica Biophysica Acta. 1801 (3), 289-298 (2010).
- Pearson, G., Soleimanpour, S. A. A ubiquitin-dependent mitophagy complex maintains mitochondrial function and insulin secretion in beta cells. Autophagy. 14 (7), 1160-1161 (2018).
- Li, J., et al. Single-cell transcriptomes reveal characteristic features of human pancreatic islet cell types. EMBO Reports. 17 (2), 178-187 (2016).
- DiGruccio, M. R., et al. Comprehensive alpha, beta and delta cell transcriptomes reveal that ghrelin selectively activates delta cells and promotes somatostatin release from pancreatic islets. Molecular Metabolism. 5 (7), 449-458 (2016).
- Lawlor, N., et al. Single-cell transcriptomes identify human islet cell signatures and reveal cell-type–specific expression changes in type 2 diabetes. Genome Research. 27 (2), 208-222 (2017).
- Dorrell, C., et al. Human islets contain four distinct subtypes of β cells. Nature Communications. 7, 11756 (2016).
- Dorrell, C., et al. Isolation of major pancreatic cell types and long-term culture-initiating cells using novel human surface markers. Stem Cell Research. 1 (3), 183-194 (2008).
- Jayaraman, S. A novel method for the detection of viable human pancreatic beta cells by flow cytometry using fluorophores that selectively detect labile zinc, mitochondrial membrane potential and protein thiols. Cytometry Part A. 73 (7), 615-625 (2008).
- Arda, H. E., et al. Age-Dependent Pancreatic Gene Regulation Reveals Mechanisms Governing Human ß-Cell Function. Cell Metabolism. 23 (5), 909-920 (2016).
- Allen, G. F. G., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).
- Villa, E., Marchetti, S., Ricci, J. -. E. No Parkin Zone: Mitophagy without Parkin. Trends in Cell Biology. , (2018).
