التصور من المجمعات Mitophagy الذاتية في الموقع في خلايا بيتا البنكرياس البشرية باستخدام القرب الربط اختبار
Summary
يحدد هذا البروتوكول طريقة للتحليل الكمي لتكوين مجمع البروتين الميتوباجي على وجه التحديد في خلايا بيتا من عينات الشُعيل البشرية الأولية. وبالتالي تسمح هذه التقنية بتحليل mitophagy من المواد البيولوجية المحدودة، والتي هي حاسمة في عينات خلايا بيتا البنكرياس البشرية الثمينة.
Abstract
Mitophagy هو مسار أساسي لمراقبة جودة الميتوكوندريا، وهو أمر بالغ الأهمية للطاقة الحيوية لخلايا بيتا في زيت البنكرياس لتغذية الأنسولين المحفز للجلوكوز. تقييم mitophagy هو التحدي وغالبا ما يتطلب الصحفيين الوراثية أو تقنيات تكميلية متعددة لا تستخدم بسهولة في عينات الأنسجة، مثل الجزر البنكرياس البشرية الأولية. هنا نبرهن على نهج قوي لتصور وتحديد تشكيل المجمعات الانقسامية الذاتية الرئيسية في جزر البنكرياس البشرية الأولية. باستخدام تقنية اختبار الربط القرب الحساسة للكشف عن التفاعل بين المنظمين mitophagy NRDP1 و USP8، ونحن قادرون على تحديد كمية تشكيل المجمعات mitophagy الأساسية في الموقع. من خلال اقتران هذا النهج لمكافحة البقع لعامل النسخ PDX1، يمكننا قياس المجمعات mitophagy، والعوامل التي يمكن أن تضعف mitophagy، وعلى وجه التحديد داخل خلايا بيتا. المنهجية التي نصفها تتغلب على الحاجة إلى كميات كبيرة من المستخلصات الخلوية اللازمة لدراسات التفاعل البروتينالبروتيني الأخرى، مثل الترسيب المناعي (IP) أو قياس الطيف الكتلي، وهي مثالية لعينات جزر الإنسان الثمينة عموما لا المتاحة بكميات كافية لهذه النهج. وعلاوة على ذلك، فإن هذه المنهجية تبطل الحاجة إلى تقنيات فرز التدفق لتنقية خلايا بيتا من مجموعة من الislet غير المتجانسة لتطبيقات البروتين في المصب. وهكذا، فإننا نصف بروتوكول قيمة لتصور mitophagy متوافقة للغاية للاستخدام في مجموعات الخلايا غير متجانسة ومحدودة.
Introduction
تنتج خلايا بيتا البنكرياس الأنسولين المطلوب للحفاظ على التوازن الجلوكوز الطبيعي، ويؤدي فشلها في تطوير جميع أشكال مرض السكري. تحتفظ خلايا بيتا بقدرة الميتوكوندريا القوية لتوليد الطاقة اللازمة لاقتران استقلاب الجلوكوز بالإفراج عن الأنسولين. في الآونة الأخيرة، أصبح من الواضح أن الحفاظ على كتلةالميتوكوندريا الوظيفية هو من الأهمية المحورية لوظيفة خلية بيتا الأمثل 1،2،3. من أجل الحفاظ على كتلة الميتوكوندريا الوظيفية، تعتمد خلايا بيتا على آليات مراقبة الجودة لإزالة الميتوكوندريا المختلة أو التالفة أو الشيخوخة4. لقد أثبتنا نحن وآخرون في السابق أن خلايا بيتا تعتمد على شكل متخصص من دوران الميتوكوندريا، يسمى الميتوكوندريا أوتوفاجي (أو الميتوثاجي)، للحفاظ على مراقبة جودة الميتوكوندريا في كل من القوارض والجزر الصغيرة البشرية1، 2،5. لسوء الحظ، ومع ذلك، لم يكن هناك طريقة بسيطة للكشف عن mitophagy، أو المكونات mitophagy أعرب عنها داخليا، في خلايا بيتا البنكرياس البشرية.
لقد أظهرنا مؤخرا أن تنظيم المنبع من mitophagy في خلايا بيتا يعتمد على تشكيل مجمع البروتين الذي يتألف من الأربطة E3 CLEC16A وNRDP1 وdeubiquitinase USP81. وقد أظهرت NRDP1 و USP8 بشكل مستقل أن تؤثر على mitophagy من خلال العمل على مفتاح mitophagy البادئ باركين6,7. NRDP1 يستهدف PARKIN لفي كل مكان وتدهور لإيقاف mitophagy6, وUSP8 deubiquitinates K6 المرتبطة باركين لتعزيز نقلها إلى الميتوكوندريا7. وقد تم إجراء تقييم الربط القرب (PLA) التكنولوجيا مؤخرا في مجال تفاعل البروتين البيولوجيا8، مما يسمح التصور من تفاعلات البروتين الذاتية في الموقع في خلايا واحدة ، ولا يحد من المواد عينة نادرة. هذه المنهجية هي تحريضية بشكل خاص لبيولوجيا الخلايا في الislet/beta البشرية، وذلك بسبب التناسل في توافر العينات، إلى جانب الحاجة إلى فهم مجمعات البروتين ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية داخل أنواع الخلايا غير المتجانسة.
الاستفادة من نهج جيش التحرير الشعبى الصينى، ونحن قادرون على مراقبة المجمعات الرئيسية الذاتية mitophagy في خلايا بيتا البنكرياس البشرية الأولية وخطوط الخلايا العصبية، وتبين آثار بيئة شيطانية على مسار mitophagy1. وباختصار، فإن الهدف الشامل لهذا البروتوكول هو تحليل مجمعات بروتين ميتوثاجي محددة في الأنسجة التي تفتقر إلى مواد وفيرة، أو حيث لا يمكن إجراء دراسات تقليدية للتفاعل بين البروتين.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا نقوم بوصف نهج بسيط وفعال لاستخدام NRDP1:USP8 PLA في الأنسجة / الخلايا ذات الأهمية لتحديد تشكيل المجمعات mitophagy المنبع. أكدنا في وقت سابق تشكيل مجمع CLEC16A-NRDP1-USP8 mitophagy في خلايا بيتا البنكرياس ية من خلال عدة منهجيات، بما في ذلك تجارب الترسيب المناعي المشترك، ودراسات التفاعل الخالي من الخلايا، وفي ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يقر المؤلفون بالدعم التمويلي المقدم من JDRF (CDA-2016-189 وSRA-2018-539)، والمعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى، والمعاهد الوطنية للصحة (R01-DK-108921)، وأسرة Brehm، وعائلة أنتوني. وتحظى جائزة التطوير الوظيفي لـ JdRF إلى S.A.S. بدعم جزئي من الأكاديمية الدانمركية للسكري، التي تدعمها مؤسسة نوفو نورديسك.
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA 1X | Life Technologies | 25200-056 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Block solution | Homemade | Use 1X PBS, add 10 % donkey serum, and 0.3% Triton X-100 detergent. | |
| Buffer A | Homemade | To make 1L: Mix 8.8g NaCl, 1.2g Tris base, 500ul Tween-20, with 750mL ddH20. pH to 7.5 with HCl, and fill to 1L. Filter solution and store at 4C. Bring to RT before experimental use | |
| Buffer B | Homemade | To make 1L: Mix 5.84g NaCl, 4.24g Tris base, 26g Tris-HCl with 500mL ddH20. pH to 7.5, and fill to 1L. Filter solution and store a 4C. Bring to RT before experimental use | |
| Cy5-conjugated AffiniPure donkey anti-goat | Jackson Labs | 705-175-147 | |
| Detection Reagents Red | Sigma- Aldrich | DU092008-100RXN | Kit containing: ligation solution stock (5X), ligase, amplification solution stock (5X) and polymerase. |
| DuoLink PLA probe anti-mouse MINUS | Sigma- Aldrich | DU092004-100RXN | |
| DuoLink PLA probe anti-rabbit PLUS | Sigma- Aldrich | DU092002-100RXN | |
| Fetal bovine serum | |||
| Goat polyclonal anti-PDX1 (clone A17) | Santa Cruz | SC-14664 | RRID: AB_2162373 |
| HEPES (1M) | Life Technologies | 15630-080 | |
| MIN6 pancreatic cell line | Gift from D. Stoffers | Mouse insulinoma cell line, utilized for cell-based assays. | |
| Mouse monoclonal anti-USP8 antibody (clone US872) | Sigma- Aldrich | SAB200527 | |
| Pap-pen | Research Products International | 195505 | |
| Parafilm | Use to seal antibody and probe solutions on your cells to prevent evaporation when using small solution volumes. | ||
| PBT (phosphate buffered saline with triton) | Homemade | To make 50mL: 43.5mLddH2O, 5mL 10X PBS, 0.5mL 10X BSA(100mg/mL solution), 1mL 10% triton X-100 solution in ddH20) | |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline, 10X | Fisher Scientific | BP399-20 | |
| PIM(ABS) Human AB serum | Prodo Labs | PIM-ABS001GMP | |
| PIM(G) (glutamine) | Prodo Labs | PIM-G001GMP | |
| PIM(S) media | Prodo Labs | PIM-S001GMP | |
| PR619 | Apex Bio | A812 | |
| Prolong Gold antifade reagent with DAPI | Life Technologies (Molecular Probes) | P36935 | |
| Rabbit polyclonal anti-FLRF/RNF41 (Nrdp1) | Bethyl Laboratories | A300-049A | RRID: AB_2181251 |
| SH-SY5Y cells | Gift from L. Satin | Human neuroblastoma cell line, utilized for cell-based assays. | |
| Sodium Pyruvate (100X) | Life Technologies | 11360-070 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| Water for RNA work (DEPC water) | Fisher Scientific | BP361-1L |
Referências
- Pearson, G., et al. Clec16a, Nrdp1, and USP8 Form a Ubiquitin-Dependent Tripartite Complex That Regulates beta-Cell Mitophagy. Diabetes. 67 (2), 265-277 (2018).
- Soleimanpour, S. A., et al. The diabetes susceptibility gene Clec16a regulates mitophagy. Cell. 157 (7), 1577-1590 (2014).
- Kaufman, B. A., Li, C., Soleimanpour, S. A. Mitochondrial regulation of β-cell function: Maintaining the momentum for insulin release. Molecular Aspects of Medicine. , (2015).
- Hattori, N., Saiki, S., Imai, Y. Regulation by mitophagy. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 53, 147-150 (2014).
- Soleimanpour, S. A., et al. Diabetes Susceptibility Genes Pdx1 and Clec16a Function in a Pathway Regulating Mitophagy in beta-Cells. Diabetes. 64 (10), 3475-3484 (2015).
- Zhong, L., Tan, Y., Zhou, A., Yu, Q., Zhou, J. RING Finger Ubiquitin-Protein Isopeptide Ligase Nrdp1/FLRF Regulates Parkin Stability and Activity. Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 9425-9430 (2005).
- Durcan, T. M., et al. USP8 regulates mitophagy by removing K6-linked ubiquitin conjugates from parkin. The EMBO Journal. 33 (21), 2473-2491 (2014).
- Gauthier, T., Claude-Taupin, A., Delage-Mourroux, R., Boyer-Guittaut, M., Hervouet, E. Proximity Ligation In situ Assay is a Powerful Tool to Monitor Specific ATG Protein Interactions following Autophagy Induction. PLoS ONE. 10 (6), e0128701 (2015).
- Silva Xavier, D. a., G, The Cells of the Islets of Langerhans. Journal of Clinical Medicine. 7 (3), 54 (2018).
- Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. Pancreatic islet plasticity: Interspecies comparison of islet architecture and composition. Islets. 2 (3), 135-145 (2010).
- Cabrera, O., et al. The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (7), 2334 (2006).
- Brissova, M., et al. Assessment of Human Pancreatic Islet Architecture and Composition by Laser Scanning Confocal Microscopy. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (9), 1087-1097 (2005).
- Babu, D. A., Deering, T. G., Mirmira, R. G. A feat of metabolic proportions: Pdx1 orchestrates islet development and function in the maintenance of glucose homeostasis. Molecular Genetics and Metabolism. 92 (1), 43-55 (2007).
- Poitout, V., et al. Glucolipotoxicity of the pancreatic beta cell. Biochimica Biophysica Acta. 1801 (3), 289-298 (2010).
- Pearson, G., Soleimanpour, S. A. A ubiquitin-dependent mitophagy complex maintains mitochondrial function and insulin secretion in beta cells. Autophagy. 14 (7), 1160-1161 (2018).
- Li, J., et al. Single-cell transcriptomes reveal characteristic features of human pancreatic islet cell types. EMBO Reports. 17 (2), 178-187 (2016).
- DiGruccio, M. R., et al. Comprehensive alpha, beta and delta cell transcriptomes reveal that ghrelin selectively activates delta cells and promotes somatostatin release from pancreatic islets. Molecular Metabolism. 5 (7), 449-458 (2016).
- Lawlor, N., et al. Single-cell transcriptomes identify human islet cell signatures and reveal cell-type–specific expression changes in type 2 diabetes. Genome Research. 27 (2), 208-222 (2017).
- Dorrell, C., et al. Human islets contain four distinct subtypes of β cells. Nature Communications. 7, 11756 (2016).
- Dorrell, C., et al. Isolation of major pancreatic cell types and long-term culture-initiating cells using novel human surface markers. Stem Cell Research. 1 (3), 183-194 (2008).
- Jayaraman, S. A novel method for the detection of viable human pancreatic beta cells by flow cytometry using fluorophores that selectively detect labile zinc, mitochondrial membrane potential and protein thiols. Cytometry Part A. 73 (7), 615-625 (2008).
- Arda, H. E., et al. Age-Dependent Pancreatic Gene Regulation Reveals Mechanisms Governing Human ß-Cell Function. Cell Metabolism. 23 (5), 909-920 (2016).
- Allen, G. F. G., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).
- Villa, E., Marchetti, S., Ricci, J. -. E. No Parkin Zone: Mitophagy without Parkin. Trends in Cell Biology. , (2018).
