Visualisatie van endogene Mitophagie complexen in situ in humane pancreas Bètacellen met behulp van proximity Ligatie test
Summary
Dit protocol schetst een methode voor kwantitatieve analyse van mitophagy eiwit complexvorming specifiek in bètacellen van primaire menselijke eilandje monsters. Deze techniek maakt dus analyse van mitophagie van beperkt biologisch materiaal mogelijk, die cruciaal zijn in de voorbeelden van kostbare humane alvleesklier bètacellen.
Abstract
Mitophagy is een essentieel mitochondriale kwaliteitscontrole traject, dat van cruciaal belang is voor beta-cel Bioenergetica van de alvleesklier om glucose-gestimuleerde insuline vrij te maken. De beoordeling van mitophagie is uitdagend en vereist vaak genetische verslaggevers of meerdere complementaire technieken die niet gemakkelijk worden gebruikt in weefselmonsters, zoals primaire menselijke alvleesklier eilandjes. Hier demonstreren we een robuuste aanpak om de vorming van belangrijke endogene mitophagie complexen in primaire menselijke pancreas eilandjes te visualiseren en kwantificeren. Met behulp van de gevoelige nabijheid ligatie assay techniek om interactie van de mitophagy regelgevers NRDP1 en USP8 te detecteren, zijn we in staat om specifiek de vorming van essentiële mitophagy complexen in situ kwantificeren. Door deze benadering van contra kleuring voor de transcriptiefactor PDX1 te koppelen, kunnen we mitophagische complexen kwantificeren, en de factoren die mitophagie kunnen aantasten, met name binnen bètacellen. De methodologie die we beschrijven, overkomt de noodzaak voor grote hoeveelheden cellulaire extracten die nodig zijn voor andere eiwit-eiwit interactiestudies, zoals immunoprecipitatie (IP) of massaspectrometrie, en is ideaal voor kostbare menselijke eilandje monsters die over het algemeen niet in voldoende hoeveelheden beschikbaar zijn voor deze benaderingen. Verder wordt met deze methodologie de noodzaak van flow Sorteer technieken voor het zuiveren van bètacellen van een heterogene eilandje populatie voor downstream eiwit toepassingen overbodig. Zo beschrijven we een waardevol protocol voor visualisatie van mitophagy dat zeer geschikt is voor gebruik in heterogene en beperkte celpopulaties.
Introduction
Pancreas bètacellen produceren de insuline die nodig is om normale glucose homeostase te handhaven, en hun falen resulteert in de ontwikkeling van alle vormen van diabetes. Bètacellen behouden een robuuste mitochondriale capaciteit om de energie te genereren die nodig is om het glucose metabolisme te koppel met insulineafgifte. Onlangs, het is duidelijk geworden dat het onderhoud van de functionele mitochondriale massa is van cruciaal belang voor optimale beta-cel functie1,2,3. Om functionele mitochondriale massa te ondersteunen, bètacellen vertrouwen op kwaliteitscontrolemechanismen te verwijderen disfunctionele, beschadigde, of veroudering mitochondriën4. Wij en anderen hebben eerder aangetoond dat bètacellen afhankelijk zijn van een gespecialiseerde vorm van mitochondriale omzet, genaamd mitochondriale autophagy (of mitophagy), om de mitochondriale kwaliteitscontrole in zowel knaagdieren als menselijke eilandjes1te behouden, 2,5. Helaas was er echter geen eenvoudige methode om mitophagie te detecteren, of endogeen uitgedrukt mitophagy componenten, in menselijke pancreas bètacellen.
We hebben onlangs aangetoond dat de upstream regulatie van mitophagie in bètacellen berust op de vorming van een eiwit complex bestaande uit de E3 ligasen CLEC16A en NRDP1 en de deubiquitinase USP81. NRDP1 en USP8 zijn onafhankelijk aangetoond dat ze de mitophagie beïnvloeden door middel van actie op de sleutel mitophagy initiator Parkin6,7. NRDP1 richt PARKIN op voor alomtegenwoordige en afbraak om mitophagy6uit te schakelen, en USP8 specifiek deubiquitinates K6-gebonden Parkin om de translocatie te bevorderen naar mitochondriën7. Proximity ligatie assay (PLA) technologie is een recente voorschot op het gebied van eiwit interactie biologie8, waardoor visualisatie van endogene eiwit interacties in situ in enkele cellen, en is niet beperkt door schaars monster materiaal. Deze methodologie is vooral aantrekkelijk voor menselijke eilandje/Beta celbiologie, als gevolg van de spaardheid van sample beschikbaarheid, gekoppeld aan de noodzaak voor het begrijpen van fysiologisch relevante eiwitcomplexen binnen heterogene celtypen.
Met behulp van de PLA-aanpak, zijn we in staat om belangrijke endogene mitophagy complexen in primaire menselijke pancreas bètacellen en neuronale cellijnen te observeren, en tonen de effecten van een diabetogenic omgeving op de mitophagy pathway1. Samenvattend, het overkoepelende doel van dit protocol is om specifieke mitophagy eiwitcomplexen te analyseren in weefsels die overvloedig materiaal missen, of waar conventionele eiwit-interactiestudies niet mogelijk zijn.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschrijven we een eenvoudige en efficiënte aanpak om NRDP1 te gebruiken: USP8 PLA in weefsels/cellen die van belang zijn om de vorming van stroomopwaartse mitophagy-complexen te kwantificeren. We hebben eerder de vorming van het CLEC16A-NRDP1-USP8 mitophagy-complex in pancreas bètacellen bevestigd door verschillende methodologieën, waaronder Co-Immunoprecipitation-experimenten, cel-vrije interactiestudies, en in vitro evenals cel-gebaseerde alomtegenwoordige assays, en toonde aan hoe dit complexe aandrijvingen g…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs erkennen financieringssteun van JDRF (CDA-2016-189 en SRA-2018-539), het Nationaal Instituut voor diabetes en spijsverterings-en nierziekten, National Institutes of Health (R01-DK-108921), de familie Brehm en de familie Anthony. De JDRF Career Development Award aan S.A.S. wordt deels ondersteund door de Deense diabetes Academie, die wordt gesteund door de Novo Nordisk Foundation.
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA 1X | Life Technologies | 25200-056 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Block solution | Homemade | Use 1X PBS, add 10 % donkey serum, and 0.3% Triton X-100 detergent. | |
| Buffer A | Homemade | To make 1L: Mix 8.8g NaCl, 1.2g Tris base, 500ul Tween-20, with 750mL ddH20. pH to 7.5 with HCl, and fill to 1L. Filter solution and store at 4C. Bring to RT before experimental use | |
| Buffer B | Homemade | To make 1L: Mix 5.84g NaCl, 4.24g Tris base, 26g Tris-HCl with 500mL ddH20. pH to 7.5, and fill to 1L. Filter solution and store a 4C. Bring to RT before experimental use | |
| Cy5-conjugated AffiniPure donkey anti-goat | Jackson Labs | 705-175-147 | |
| Detection Reagents Red | Sigma- Aldrich | DU092008-100RXN | Kit containing: ligation solution stock (5X), ligase, amplification solution stock (5X) and polymerase. |
| DuoLink PLA probe anti-mouse MINUS | Sigma- Aldrich | DU092004-100RXN | |
| DuoLink PLA probe anti-rabbit PLUS | Sigma- Aldrich | DU092002-100RXN | |
| Fetal bovine serum | |||
| Goat polyclonal anti-PDX1 (clone A17) | Santa Cruz | SC-14664 | RRID: AB_2162373 |
| HEPES (1M) | Life Technologies | 15630-080 | |
| MIN6 pancreatic cell line | Gift from D. Stoffers | Mouse insulinoma cell line, utilized for cell-based assays. | |
| Mouse monoclonal anti-USP8 antibody (clone US872) | Sigma- Aldrich | SAB200527 | |
| Pap-pen | Research Products International | 195505 | |
| Parafilm | Use to seal antibody and probe solutions on your cells to prevent evaporation when using small solution volumes. | ||
| PBT (phosphate buffered saline with triton) | Homemade | To make 50mL: 43.5mLddH2O, 5mL 10X PBS, 0.5mL 10X BSA(100mg/mL solution), 1mL 10% triton X-100 solution in ddH20) | |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline, 10X | Fisher Scientific | BP399-20 | |
| PIM(ABS) Human AB serum | Prodo Labs | PIM-ABS001GMP | |
| PIM(G) (glutamine) | Prodo Labs | PIM-G001GMP | |
| PIM(S) media | Prodo Labs | PIM-S001GMP | |
| PR619 | Apex Bio | A812 | |
| Prolong Gold antifade reagent with DAPI | Life Technologies (Molecular Probes) | P36935 | |
| Rabbit polyclonal anti-FLRF/RNF41 (Nrdp1) | Bethyl Laboratories | A300-049A | RRID: AB_2181251 |
| SH-SY5Y cells | Gift from L. Satin | Human neuroblastoma cell line, utilized for cell-based assays. | |
| Sodium Pyruvate (100X) | Life Technologies | 11360-070 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| Water for RNA work (DEPC water) | Fisher Scientific | BP361-1L |
Referências
- Pearson, G., et al. Clec16a, Nrdp1, and USP8 Form a Ubiquitin-Dependent Tripartite Complex That Regulates beta-Cell Mitophagy. Diabetes. 67 (2), 265-277 (2018).
- Soleimanpour, S. A., et al. The diabetes susceptibility gene Clec16a regulates mitophagy. Cell. 157 (7), 1577-1590 (2014).
- Kaufman, B. A., Li, C., Soleimanpour, S. A. Mitochondrial regulation of β-cell function: Maintaining the momentum for insulin release. Molecular Aspects of Medicine. , (2015).
- Hattori, N., Saiki, S., Imai, Y. Regulation by mitophagy. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 53, 147-150 (2014).
- Soleimanpour, S. A., et al. Diabetes Susceptibility Genes Pdx1 and Clec16a Function in a Pathway Regulating Mitophagy in beta-Cells. Diabetes. 64 (10), 3475-3484 (2015).
- Zhong, L., Tan, Y., Zhou, A., Yu, Q., Zhou, J. RING Finger Ubiquitin-Protein Isopeptide Ligase Nrdp1/FLRF Regulates Parkin Stability and Activity. Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 9425-9430 (2005).
- Durcan, T. M., et al. USP8 regulates mitophagy by removing K6-linked ubiquitin conjugates from parkin. The EMBO Journal. 33 (21), 2473-2491 (2014).
- Gauthier, T., Claude-Taupin, A., Delage-Mourroux, R., Boyer-Guittaut, M., Hervouet, E. Proximity Ligation In situ Assay is a Powerful Tool to Monitor Specific ATG Protein Interactions following Autophagy Induction. PLoS ONE. 10 (6), e0128701 (2015).
- Silva Xavier, D. a., G, The Cells of the Islets of Langerhans. Journal of Clinical Medicine. 7 (3), 54 (2018).
- Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. Pancreatic islet plasticity: Interspecies comparison of islet architecture and composition. Islets. 2 (3), 135-145 (2010).
- Cabrera, O., et al. The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (7), 2334 (2006).
- Brissova, M., et al. Assessment of Human Pancreatic Islet Architecture and Composition by Laser Scanning Confocal Microscopy. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (9), 1087-1097 (2005).
- Babu, D. A., Deering, T. G., Mirmira, R. G. A feat of metabolic proportions: Pdx1 orchestrates islet development and function in the maintenance of glucose homeostasis. Molecular Genetics and Metabolism. 92 (1), 43-55 (2007).
- Poitout, V., et al. Glucolipotoxicity of the pancreatic beta cell. Biochimica Biophysica Acta. 1801 (3), 289-298 (2010).
- Pearson, G., Soleimanpour, S. A. A ubiquitin-dependent mitophagy complex maintains mitochondrial function and insulin secretion in beta cells. Autophagy. 14 (7), 1160-1161 (2018).
- Li, J., et al. Single-cell transcriptomes reveal characteristic features of human pancreatic islet cell types. EMBO Reports. 17 (2), 178-187 (2016).
- DiGruccio, M. R., et al. Comprehensive alpha, beta and delta cell transcriptomes reveal that ghrelin selectively activates delta cells and promotes somatostatin release from pancreatic islets. Molecular Metabolism. 5 (7), 449-458 (2016).
- Lawlor, N., et al. Single-cell transcriptomes identify human islet cell signatures and reveal cell-type–specific expression changes in type 2 diabetes. Genome Research. 27 (2), 208-222 (2017).
- Dorrell, C., et al. Human islets contain four distinct subtypes of β cells. Nature Communications. 7, 11756 (2016).
- Dorrell, C., et al. Isolation of major pancreatic cell types and long-term culture-initiating cells using novel human surface markers. Stem Cell Research. 1 (3), 183-194 (2008).
- Jayaraman, S. A novel method for the detection of viable human pancreatic beta cells by flow cytometry using fluorophores that selectively detect labile zinc, mitochondrial membrane potential and protein thiols. Cytometry Part A. 73 (7), 615-625 (2008).
- Arda, H. E., et al. Age-Dependent Pancreatic Gene Regulation Reveals Mechanisms Governing Human ß-Cell Function. Cell Metabolism. 23 (5), 909-920 (2016).
- Allen, G. F. G., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).
- Villa, E., Marchetti, S., Ricci, J. -. E. No Parkin Zone: Mitophagy without Parkin. Trends in Cell Biology. , (2018).
