Visualisation des complexes mitophatonus endogènes in situ dans les cellules bêta pancréatiques humaines utilisant l'analyse de la ligation de proximité
Summary
Ce protocole décrit une méthode pour l’analyse quantitative de la formation complexe de protéine de mitophagie spécifiquement dans les cellules bêta des échantillons humains primaires d’islet. Cette technique permet ainsi l’analyse de la mitophagie à partir de matériel biologique limité, qui sont cruciaux dans les échantillons précieux de cellules bêta pancréatiques humaines précieuses.
Abstract
La mitophagie est une voie de contrôle de la qualité mitochondriale essentielle, qui est cruciale pour les bioénergétiques de cellules bêta d’écœuras pancréatiques pour alimenter la libération d’insuline glucose-stimulée. L’évaluation de la mitophagie est difficile et nécessite souvent des journalistes génétiques ou de multiples techniques complémentaires pas facilement utilisées dans les échantillons de tissus, tels que les îlots pancréatiques humains primaires. Ici nous démontrons une approche robuste pour visualiser et quantifier la formation des complexes endogènes principaux de mitophagie dans les îlots pancréatiques humains primaires. En utilisant la technique d’analyse de la ligature de proximité sensible pour détecter l’interaction des régulateurs de mitophagie NRDP1 et USP8, nous sommes en mesure de quantifier spécifiquement la formation de complexes essentiels de mitophagie in situ. En couplant cette approche pour contrer le facteur de transcription PDX1, nous pouvons quantifier les complexes de mitophagie, et les facteurs qui peuvent altérer la mitophagie, en particulier dans les cellules bêta. La méthodologie que nous décrivons surmonte le besoin de grandes quantités d’extraits cellulaires nécessaires pour d’autres études d’interaction protéine-protéine, telles que l’immunoprécipitation (IP) ou la spectrométrie de masse, et est idéale pour les échantillons humains précieux d’îc généralement pas disponibles en quantités suffisantes pour ces approches. En outre, cette méthodologie évite la nécessité de techniques de tri de flux pour purifier les cellules bêta d’une population hétérogène d’îlet pour les applications de protéines en aval. Ainsi, nous décrivons un protocole valable pour la visualisation de la mitophagie fortement compatible pour l’usage dans les populations hétérogènes et limitées de cellules.
Introduction
Les cellules bêta pancréatiques produisent l’insuline nécessaire pour maintenir l’homéostasie normale de glucose, et leurs résultats d’échec dans le développement de toutes les formes de diabète. Les cellules bêta conservent une capacité mitochondriale robuste pour générer l’énergie nécessaire pour coupler le métabolisme du glucose avec la libération d’insuline. Récemment, il est devenu évident que le maintien de la masse mitochondriale fonctionnelle est d’une importance essentielle pour la fonction cellulaire bêta optimale1,2,3. Afin de soutenir la masse mitochondriale fonctionnelle, les cellules bêta comptent sur desmécanismes de contrôle de qualité pour enlever les mitochondries dysfonctionnelles, endommagées ou vieillissantes 4. Nous et d’autres avons précédemment démontré que les cellules bêta s’appuient sur une forme spécialisée de rotation mitochondriale, appelée autophagie mitochondriale (ou mitophagie), pour maintenir le contrôle de la qualité mitochondriale dans les îlots de rongeurs et humains1, 2,5. Malheureusement, cependant, il n’y avait aucune méthode simple pour détecter la mitophagie, ou les composants endogènement exprimés de mitophagie, dans les cellules bêta pancréatiques humaines.
Nous avons récemment montré que la régulation en amont de la mitophagie dans les cellules bêta repose sur la formation d’un complexe protéique comprenant les ligases E3 CLEC16A et NRDP1 et les usP81. NRDP1 et USP8 ont été montrés indépendamment pour affecter la mitophagie par l’action sur l’initiateur de mitophagie clé PARKIN6,7. NRDP1 cible PARKIN pour l’ubiquitination et la dégradation pour éteindre la mitophagie6, et USP8 spécifiquement deubiquitinates K6-lié PARKIN pour promouvoir sa translocation aux mitochondries7. La technologie d’essai de ligature de proximité (PLA) a été une avancée récente dans le domaine de la biologie de l’interaction protéique8, permettant la visualisation des interactions protéiques endogènes in situ dans des cellules individuelles, et n’est pas limitée par le matériel d’échantillon rare. Cette méthodologie est particulièrement attrayante pour la biologie des îlettes/bêta humains, en raison de la rareté de la disponibilité de l’échantillon, couplée à la nécessité de comprendre les complexes protéiques physiologiquement pertinents dans les types de cellules hétérogènes.
En utilisant l’approche PLA, nous sommes en mesure d’observer les principaux complexes de mitophagie endogène dans les cellules bêta pancréatiques humaines primaires et les lignées cellulaires neuronales, et de démontrer les effets d’un environnement diabétogénique sur la voie de la mitophagie1. En résumé, l’objectif principal de ce protocole est d’analyser des complexes protéiques mitophatophanes spécifiques dans les tissus dépourvus de matériaux abondants, ou lorsque les études conventionnelles d’interaction des protéines ne sont pas possibles.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici nous décrivons une approche simple et efficace pour employer NRDP1:USP8 PLA dans les tissus/cellules d’intérêt pour quantifier la formation des complexes de mitophagie en amont. Nous avons précédemment confirmé la formation du complexe de mitophagie cLEC16A-NRDP1-USP8 dans les cellules bêta pancréatiques par plusieurs méthodologies, y compris des expériences de co-immunoprécipitation, des études d’interaction sans cellules, et in vitro aussi bien que des cellules-basées ubiquitination tests, et a démont…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs reconnaissent le soutien financier de la FRDJ (CDA-2016-189 et SRA-2018-539), de l’Institut national du diabète et des maladies digestives et rénales, des National Institutes of Health (R01-DK-108921), de la famille Brehm et de la famille Anthony. Le Prix de développement de carrière de la FRDJ à S.A.S. est en partie soutenu par l’Académie danoise du diabète, qui est soutenue par la Fondation Novo Nordisk.
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA 1X | Life Technologies | 25200-056 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Block solution | Homemade | Use 1X PBS, add 10 % donkey serum, and 0.3% Triton X-100 detergent. | |
| Buffer A | Homemade | To make 1L: Mix 8.8g NaCl, 1.2g Tris base, 500ul Tween-20, with 750mL ddH20. pH to 7.5 with HCl, and fill to 1L. Filter solution and store at 4C. Bring to RT before experimental use | |
| Buffer B | Homemade | To make 1L: Mix 5.84g NaCl, 4.24g Tris base, 26g Tris-HCl with 500mL ddH20. pH to 7.5, and fill to 1L. Filter solution and store a 4C. Bring to RT before experimental use | |
| Cy5-conjugated AffiniPure donkey anti-goat | Jackson Labs | 705-175-147 | |
| Detection Reagents Red | Sigma- Aldrich | DU092008-100RXN | Kit containing: ligation solution stock (5X), ligase, amplification solution stock (5X) and polymerase. |
| DuoLink PLA probe anti-mouse MINUS | Sigma- Aldrich | DU092004-100RXN | |
| DuoLink PLA probe anti-rabbit PLUS | Sigma- Aldrich | DU092002-100RXN | |
| Fetal bovine serum | |||
| Goat polyclonal anti-PDX1 (clone A17) | Santa Cruz | SC-14664 | RRID: AB_2162373 |
| HEPES (1M) | Life Technologies | 15630-080 | |
| MIN6 pancreatic cell line | Gift from D. Stoffers | Mouse insulinoma cell line, utilized for cell-based assays. | |
| Mouse monoclonal anti-USP8 antibody (clone US872) | Sigma- Aldrich | SAB200527 | |
| Pap-pen | Research Products International | 195505 | |
| Parafilm | Use to seal antibody and probe solutions on your cells to prevent evaporation when using small solution volumes. | ||
| PBT (phosphate buffered saline with triton) | Homemade | To make 50mL: 43.5mLddH2O, 5mL 10X PBS, 0.5mL 10X BSA(100mg/mL solution), 1mL 10% triton X-100 solution in ddH20) | |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline, 10X | Fisher Scientific | BP399-20 | |
| PIM(ABS) Human AB serum | Prodo Labs | PIM-ABS001GMP | |
| PIM(G) (glutamine) | Prodo Labs | PIM-G001GMP | |
| PIM(S) media | Prodo Labs | PIM-S001GMP | |
| PR619 | Apex Bio | A812 | |
| Prolong Gold antifade reagent with DAPI | Life Technologies (Molecular Probes) | P36935 | |
| Rabbit polyclonal anti-FLRF/RNF41 (Nrdp1) | Bethyl Laboratories | A300-049A | RRID: AB_2181251 |
| SH-SY5Y cells | Gift from L. Satin | Human neuroblastoma cell line, utilized for cell-based assays. | |
| Sodium Pyruvate (100X) | Life Technologies | 11360-070 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| Water for RNA work (DEPC water) | Fisher Scientific | BP361-1L |
Referências
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