Visualizzazione di complessi mitogeni endogeni in Situ in cellule beta pancreatiche umane utilizzando la generazione di testdi di ligazione di prossimità
Summary
Questo protocollo delinea un metodo per l’analisi quantitativa della formazione complessa di proteine mitopagia specificamente nelle cellule beta da campioni di isolotto umano primario. Questa tecnica consente quindi l’analisi della mitofagia da materiale biologico limitato, che sono cruciali nei preziosi campioni di cellule beta pancreatiche umane.
Abstract
La mitofagia è un percorso di controllo della qualità mitocondriale essenziale, che è fondamentale per la bioenergetica delle cellule beta delle isoloti pancreatiche per alimentare il rilascio di insulina stimolato dal glucosio. La valutazione della mitofagia è impegnativa e spesso richiede giornalisti genetici o molteplici tecniche complementari non facilmente utilizzate in campioni di tessuto, come le isole pancreatiche primarie umane. Qui dimostriamo un approccio robusto per visualizzare e quantificare la formazione di complessi chiave di mitofagia endogena nelle isole pancreatiche primarie. Utilizzando la tecnica di analisi della legatura di prossimità sensibile per rilevare l’interazione dei regolatori di mitopagia NRDP1 e USP8, siamo in grado di quantificare specificamente la formazione di complessi mitopagia essenziali in situ. Accresciuto questo approccio per contrastare la controtendenza per il fattore di trascrizione PDX1, possiamo quantificare i complessi di mitofagia e i fattori che possono compromettere la mitofagia, in particolare all’interno delle cellule beta. La metodologia che descriviamo supera la necessità di grandi quantità di estratti cellulari necessari per altri studi di interazione proteina-proteina, come l’immunoprecipitazioni (IP) o la spettrometria di massa, ed è ideale per preziosi campioni di isole umane generalmente non disponibili in quantità sufficienti per questi approcci. Inoltre, questa metodologia evita la necessità di tecniche di selezione del flusso per purificare le cellule beta da una popolazione di isolotto eterogeneo per applicazioni di proteine a valle. Perquesto, descriviamo un protocollo prezioso per la visualizzazione della mitofagia altamente compatibile per l’uso in popolazioni cellulari eterogenee e limitate.
Introduction
Le cellule beta pancreatiche producono l’insulina necessaria per mantenere l’omeostasi normale del glucosio e il loro fallimento si traduce nello sviluppo di tutte le forme di diabete. Le cellule beta mantengono una robusta capacità mitocondriale per generare l’energia necessaria per accoppiare il metabolismo del glucosio con rilascio di insulina. Recentemente, è diventato evidente che il mantenimento della massa mitocondriale funzionale è di fondamentale importanza per la funzione ottimale della cella beta1,2,3. Al fine di sostenere la massa mitocondriale funzionale, le cellule beta si basano su meccanismi di controllo di qualità per rimuovere i mitocondri disfunzionali, danneggiati o i mitocondri di invecchiamento4 . Noi e altri abbiamo precedentemente dimostrato che le cellule beta si basano su una forma specializzata di turnover mitocondriale, chiamata autofagia mitocondriale (o mitopagia), per mantenere il controllo della qualità mitocondriale sia nei roditori che nelle isole umane1, 2,5. Purtroppo, tuttavia, non esisteva un metodo semplice per rilevare la mitofagia, o componenti mitoplasmasi endogenamente espressi, nelle cellule beta pancreatiche umane.
Recentemente abbiamo dimostrato che la regolazione a monte della mitofagia nelle cellule beta si basa sulla formazione di un complesso proteico che comprende i legamenti E3 CLEC16A e NRDP1 e la deubiquitinasi USP81. NRDP1 e USP8 hanno dimostrato indipendentemente di influenzare la mitopfagia attraverso l’azione sull’initiatore di mitopfagia chiave PARKIN6,7. NRDP1 si rivolge a PARKIN per l’ubiquitinazione e la degradazione per spegnere la mitofagia6e USP8 deubiquitinates specificamente PARKIN K6-linked per promuovere la sua traslocazione a mitocondri7. La tecnologia di analisi della legatura di prossimità (PLA) èstata un recente progresso nel campo della biologia dell’interazione delle proteine 8, consentendo la visualizzazione di interazioni endogene di proteine in situ in singole cellule e non è limitata da scarsi materiali campione. Questa metodologia è particolarmente allettante per la biologia delle cellule umane-beta, a causa della disponibilità del campione, unita alla necessità di comprendere i complessi proteici fisiologicamente rilevanti all’interno di tipi di cellule eterogenee.
Utilizzando l’approccio PLA, siamo in grado di osservare i principali complessi mitogeni endogeni nelle cellule beta pancreatiche umane primarie e nelle linee cellulari neuronali, e dimostrare gli effetti di un ambiente diabegenico sul percorso mitopfagia1. In sintesi, l’obiettivo generale di questo protocollo è quello di analizzare specifici complessi proteici mitopagia in tessuti privi di materiale abbondante, o dove non sono possibili studi convenzionali di interazione proteica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui descriviamo un approccio semplice ed efficiente per utilizzare NRDP1:USP8 PLA in tessuti/cellule di interesse per quantificare la formazione di complessi mitopagia a monte. In precedenza abbiamo confermato la formazione del complesso mitopagy CLEC16A-NRDP1-USP8 nelle cellule beta pancreatiche da diverse metodologie, tra cui esperimenti di co-immunoprecipitazioni, studi di interazione senza cellule e in vitro e analisi dell’ubiquitinazione, e ha dimostrato come questo complesso aziona regolato flusso mitofagico<sup cl…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori riconoscono il sostegno al finanziamento da JDRF (CDA-2016-189 e SRA-2018-539), il National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, National Institutes of Health (R01-DK-108921), la famiglia Brehm e la famiglia Anthony. Il JDRF Career Development Award a S.A.S. è in parte sostenuto dalla Danish Diabetes Academy, sostenuta dalla Novo Nordisk Foundation.
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA 1X | Life Technologies | 25200-056 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Block solution | Homemade | Use 1X PBS, add 10 % donkey serum, and 0.3% Triton X-100 detergent. | |
| Buffer A | Homemade | To make 1L: Mix 8.8g NaCl, 1.2g Tris base, 500ul Tween-20, with 750mL ddH20. pH to 7.5 with HCl, and fill to 1L. Filter solution and store at 4C. Bring to RT before experimental use | |
| Buffer B | Homemade | To make 1L: Mix 5.84g NaCl, 4.24g Tris base, 26g Tris-HCl with 500mL ddH20. pH to 7.5, and fill to 1L. Filter solution and store a 4C. Bring to RT before experimental use | |
| Cy5-conjugated AffiniPure donkey anti-goat | Jackson Labs | 705-175-147 | |
| Detection Reagents Red | Sigma- Aldrich | DU092008-100RXN | Kit containing: ligation solution stock (5X), ligase, amplification solution stock (5X) and polymerase. |
| DuoLink PLA probe anti-mouse MINUS | Sigma- Aldrich | DU092004-100RXN | |
| DuoLink PLA probe anti-rabbit PLUS | Sigma- Aldrich | DU092002-100RXN | |
| Fetal bovine serum | |||
| Goat polyclonal anti-PDX1 (clone A17) | Santa Cruz | SC-14664 | RRID: AB_2162373 |
| HEPES (1M) | Life Technologies | 15630-080 | |
| MIN6 pancreatic cell line | Gift from D. Stoffers | Mouse insulinoma cell line, utilized for cell-based assays. | |
| Mouse monoclonal anti-USP8 antibody (clone US872) | Sigma- Aldrich | SAB200527 | |
| Pap-pen | Research Products International | 195505 | |
| Parafilm | Use to seal antibody and probe solutions on your cells to prevent evaporation when using small solution volumes. | ||
| PBT (phosphate buffered saline with triton) | Homemade | To make 50mL: 43.5mLddH2O, 5mL 10X PBS, 0.5mL 10X BSA(100mg/mL solution), 1mL 10% triton X-100 solution in ddH20) | |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline, 10X | Fisher Scientific | BP399-20 | |
| PIM(ABS) Human AB serum | Prodo Labs | PIM-ABS001GMP | |
| PIM(G) (glutamine) | Prodo Labs | PIM-G001GMP | |
| PIM(S) media | Prodo Labs | PIM-S001GMP | |
| PR619 | Apex Bio | A812 | |
| Prolong Gold antifade reagent with DAPI | Life Technologies (Molecular Probes) | P36935 | |
| Rabbit polyclonal anti-FLRF/RNF41 (Nrdp1) | Bethyl Laboratories | A300-049A | RRID: AB_2181251 |
| SH-SY5Y cells | Gift from L. Satin | Human neuroblastoma cell line, utilized for cell-based assays. | |
| Sodium Pyruvate (100X) | Life Technologies | 11360-070 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| Water for RNA work (DEPC water) | Fisher Scientific | BP361-1L |
Referências
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