Visualização de complexos de Mitophagy endógenos in situ em células beta pancreáticas humanas utilizando o ensaio de ligadura de proximidade

Summary

Este protocolo esboça um método para a análise quantitativa da formação complexa da proteína do mitofagia especificamente em pilhas beta das amostras preliminares do Islet humano. Esta técnica permite assim a análise da mitofagia do material biológico limitado, que são cruciais em amostras pancreatic humanas preciosas da pilha beta.

Abstract

Mitophagy é uma via de controle de qualidade mitocondrial essencial, que é crucial para bioenergética de células beta de Islet pancreáticas para abastecer a liberação de insulina estimulada por glicose. A avaliação da mitophagia é desafiadora e muitas vezes requer repórteres genéticos ou múltiplas técnicas complementares não facilmente utilizadas em amostras de tecido, como as ilhotas pancreáticas primárias humanas. Aqui nós demonstramos uma aproximação robusta para visualizar e quantificar a formação de complexos endógenos principais do mitofagia em ilhotas pancreatic humanas preliminares. Utilizando a técnica sensível do ensaio da ligadura da proximidade para detectar a interação dos reguladores NRDP1 e USP8 de mitofagia, nós podemos quantificar especificamente a formação de complexos mitofagia essenciais in situ. Ao acoplar essa abordagem à contracepção para o fator de transcrição PDX1, podemos quantificar complexos de mitophagia, e os fatores que podem prejudicar a mitofagia, especificamente dentro das células beta. A metodologia que descrevemos supera a necessidade de grandes quantidades de extratos celulares necessários para outros estudos de interação proteína-proteína, como a imunoprecipitação (IP) ou espectrometria de massas, e é ideal para amostras de Islet humanas preciosas geralmente não disponíveis em quantidades suficientes para estas abordagens. Além disso, esta metodologia elimina a necessidade de técnicas de triagem de fluxo para purificar as células beta de uma população de Ilhéus heterogêneo para aplicações proteicas a jusante. Assim, nós descrevemos um protocolo valioso para o visualização do mitofagia altamente-compatível para o uso em populações heterogêneas e limitadas da pilha.

Introduction

As células beta pancreáticas produzem a insulina necessária para manter a homeostase normal da glicose, e sua falha resulta no desenvolvimento de todas as formas de diabetes. As células beta mantêm uma capacidade mitocondrial robusta para gerar a energia necessária para o metabolismo da glicose de casal com liberação de insulina. Recentemente, tornou-se evidente que a manutenção da massa mitocondrial funcional é de importância crucial para a função de célula beta ideal^1,2,3. A fim de sustentar a massa mitocondrial funcional, as células beta dependem de mecanismos de controle ....

Protocol

O uso de ilhotas pancreáticas humanas de doadores desidentificados é através de uma isenção do Conselho de revisão institucional (IRB) e em conformidade com a política da Universidade de Michigan IRB. As ilhotas pancreáticas humanas foram fornecidas pelo NIH/NIDDK-programa integrado de distribuição de ilhotas (IIDP).

1. preparação da amostra da ilíte humana

1. Dissociação de uma única célula
   1. Cultura de amostras de ilhao humano (4000 – 6000 Islet equivalentes/10 mL Media) por pelo menos 1 dia a 37 ° c em meios de Islet pancreáticos (PIM (S)) meios suplementados com 1 mM de glutamina (PIM (G)), 100 unidades/....

Results

Realizamos experimentos iniciais na linha de células beta pancreáticas MIN6 e na linha de células de neuroblastoma SH-SY5Y SH-SY5Y, para otimizar e confirmar tanto a especificidade dos anticorpos quanto as interações protéicas visualizadas. As pilhas de MIN6 foram chapeadas em COVERSLIP em 30.000 Cells/mL e deixadas para aderir para 48 h, as pilhas SH-SY5Y foram chapeadas em COVERSLIP em 15.000 Cells/mL e deixadas para aderir para 24 h. O protocolo PLA foi então seguido como acima, começa.......

Discussion

Aqui nós descrevemos uma abordagem simples e eficiente para usar NRDP1: USP8 PLA em tecidos/células de interesse para quantificar a formação de complexos de mitofagia upstream. Nós confirmamos previamente a formação do complexo do mitofagia de CLEC16A-NRDP1-USP8 em pilhas beta pancreatic por diversas metodologias, incluindo experimentos da coimunoprecipitação, estudos Cell-Free da interação, e in vitro assim como o Cell-Based ensaios de ubiquitinação e demonstraram como esse complexo impulsiona o fluxo mitofágico

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,25% de tripsina-EDTA 1X	Life Technologies	25200-056
Antibiótico-Antimicótico	Life Technologies	15240-062
Solução em bloco	Uso caseiro		1X PBS, adicione 10% de soro de burro e 0,3% de detergente Triton X-100.
Tampão A	Caseiro		Para fazer 1L: Misture 8,8g de NaCl, 1,2g de base Tris, 500ul Tween-20, com 750mL ddH20. pH a 7,5 com HCl e encha a 1L. Filtre a solução e armazene a 4C. Leve ao RT antes do uso experimental
Tampão B	Caseiro		Para fazer 1L: Misture 5,84g de NaCl, 4,24g de base Tris, 26g de Tris-HCl com 500mL ddH20. pH a 7,5, e encha até 1L. Filtre a solução e armazene um 4C. Traga para RT antes do uso experimental
Cy5-conjugado AffiniPure burro anti-cabra	Jackson Labs	705-175-147
Reagentes de detecção Red	Sigma-Aldrich	DU092008-100RXN	Kit contendo: estoque de solução de ligação (5X), ligase, estoque de solução de amplificação (5X) e polimerase.
Sonda DuoLink PLA anti-mouse MENOS	Sigma- Aldrich	DU092004-100RXN
Sonda DuoLink PLA anti-coelho PLUS	Sigma- Aldrich	DU092002-100RXN
Soro
Cabra policlonal anti-PDX1 (clone A17)	Santa Cruz	SC-14664	RRID: AB_2162373
HEPES (1M)	Life Technologies	15630-080
Linha celular pancreática MIN6	Presente da linha celular de		, utilizada para ensaios baseados em células.
Anticorpo monoclonal anti-USP8 de camundongo (clone US872)	Sigma- Aldrich	SAB200527
Pap-pen	Research Products International	195505
Parafilm			Use para selar soluções de anticorpos e sondagens em suas células para evitar a evaporação ao usar pequenos volumes de solução.
PBT (solução salina tamponada com fosfato com triton)	Caseiro		Para fazer 50mL: 43,5mLddH2O, 5mL 10X PBS, 0,5mL 10X BSA (solução de 100mg / mL), solução de 1mL 10% triton X-100 em ddH20)
Penicilina-Estreptomicina (100X)	Life Technologies	15140-122
Solução salina tamponada com fosfato, 10X	Fisher Scientific	BP399-20
PIM(ABS) Soro AB humano	Prodo Labs	PIM-ABS001GMP
PIM(G) (glutamina)	Prodo Labs	PIM-G001GMP
PIM(S) mídia	Prodo Labs	PIM-S001GMP
PR619	Apex Bio	A812
Prolong Gold reagente antifade com DAPI	Life Technologies (Sondas Moleculares)	P36935
Coelho policlonal anti-FLRF / RNF41 (Nrdp1)	Bethyl Laboratories	A300-049A	RRID: AB_2181251
células SH-SY5Y	Presente de L. Satin		Linha celular de neuroblastoma humano, utilizada para ensaios baseados em células.
Piruvato de Sódio (100X)	Life Technologies	11360-070
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-100
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-100
Água para trabalho de RNA (água DEPC)	Fisher Scientific	BP361-1L