근접 결찰 분석분석서를 활용한 인간 췌장 베타 세포에서 내인성 미토파기 복합체의 시각화
Summary
이 프로토콜은 1차 인간 아일렛 샘플로부터의 베타 세포에서 특히 미토파지 단백질 복합체 형성의 정량적 분석을 위한 방법을 간략하게 설명한다. 이 기술은 이렇게 귀중한 인간 췌장 베타 세포 견본에서 결정적인 한정된 생물학 물자에서 mitophagy의 분석을 허용합니다.
Abstract
미토파지는 필수 미토콘드리아 품질 관리 경로로, 췌도 베타 세포 바이오에너지가 포도당 자극 인슐린 방출에 연료를 공급하는 데 매우 중요합니다. mitophagy의 평가는 도전적이고 수시로 1 차적인 인간 췌장 섬과 같은 조직 견본에서 쉽게 이용되지 않는 유전 기자 또는 다중 상보적인 기술을 요구합니다. 여기에서 우리는 1 차적인 인간 적인 췌도에 있는 중요한 내인성 mitophagy 복합물의 대형을 구상하고 정량화하는 강력한 접근을 보여줍니다. 미토파지 조절제 NRDP1 및 USP8의 상호작용을 검출하기 위해 민감한 근접 결찰 분석 기술을 활용하여, 우리는 특히 그(것)들에서 필수적인 미토파지 복합체의 형성을 정량화할 수 있습니다. 전사 인자 PDX1에 대한 역착에 대한 이 접근법을 결합함으로써, 우리는 미토파지 복합체, 특히 베타 세포 내에서 미토파지를 손상시킬 수 있는 요인을 정량화할 수 있다. 우리가 설명하는 방법론은 면역 침전 (IP) 또는 질량 분광법과 같은 다른 단백질 상호 작용 연구에 필요한 다량의 세포 추출물의 필요성을 극복하고 일반적으로 귀중한 인간 췌도 샘플에 이상적입니다. 이러한 접근 방식에 충분한 수량으로 사용할 수 있습니다. 또한, 이 방법론은 다운스트림 단백질 응용을 위한 이기종 아일렛 집단으로부터 베타 세포를 정화하는 유동 선별 기술의 필요성을 제거합니다. 따라서, 우리는 이기종 및 제한된 세포 집단에서 사용하기 위해 매우 호환되는 미토파기의 시각화를 위한 귀중한 프로토콜을 기술한다.
Introduction
췌장 베타 세포는 정상적인 포도당 항상성을 유지하는 데 필요한 인슐린을 생성하고, 그들의 실패는 모든 형태의 당뇨병의 발달을 초래한다. 베타 세포는 인슐린 방출과 포도당 대사를 결합하는 데 필요한 에너지를 생성하는 강력한 미토콘드리아 용량을 유지합니다. 최근에는 기능성 미토콘드리아 질량의 유지가 최적의 베타 세포 기능1,2,3에중추적인 중요성이 있음이 명백해지고 있다. 기능성 미토콘드리아 질량을 유지하기 위해 베타 세포는 기능 장애, 손상 또는 노화 미토콘드리아4를제거하기 위해 품질 관리 메커니즘에 의존합니다. 우리와 다른 사람들은 이전에 베타 세포가 설치류와 인간 섬 모두에서 미토콘드리아 품질 관리를 유지하기 위해 미토콘드리아 자가 포식 (또는 미토파지)이라고 불리는 미토콘드리아 회전율의 특수 한 형태에 의존한다는 것을 입증했습니다1. 2,5. 불행하게도, 그러나, 인간 췌장 베타 세포에서, mitophagy, 또는 내인성 발현 된 미토파지 성분을 검출하는 간단한 방법이 없었다.
우리는 최근 베타 세포에서 미토파지의 상류 조절이 E3 리가제 CLEC16A 및 NRDP1 및 듀비퀴티나아제 USP81을 포함하는 단백질 복합체의 형성에 의존한다는 것을 보여주었다. NRDP1과 USP8은 키 미토파지 이니시에이터 PARKIN6,7에대한 조치를 통해 미토파지에 영향을 미치는 것으로 독립적으로 나타났다. NRDP1은 미토파지 6을 끄기 위해 유비퀴틴화및 분해를 위한 PARKIN을 목표로 하고, USP8은 특히 K6-연결된 PARKIN을 미토콘드리아7로전좌화하기 위해 타겟팅합니다. 근접 결찰 분석(PLA) 기술은 단백질 상호작용 생물학분야에서최근 진보되어 왔으며, 단일 세포에서 현장내 내인성 단백질 상호작용의 시각화를 가능하게 하고, 부족한 샘플 물질에 의해 제한되지 않는다. 이 방법론은 특히 인간 췌도/베타 세포 생물학에 대해 특히 유혹적이며, 표본 가용성의 희소성으로 인해 이기종 세포 유형 내에서 생리학적으로 관련된 단백질 복합체를 이해해야 할 필요성과 결합됩니다.
PLA 접근법을 활용하여, 우리는 1차 인간 췌장 베타 세포 및 뉴런 세포주에서 주요 내인성 미토파지 복합체를 관찰할 수 있으며, 미토파지 경로1에대한 당뇨병 환경의 효과를 입증할 수 있다. 요약하자면, 이 프로토콜의 가장 중요한 목표는 풍부한 물질이 부족한 조직또는 기존의 단백질 상호작용 연구가 불가능한 조직에서 특정 미토파지 단백질 복합체를 분석하는 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서 우리는 상류 mitophagy 복합물의 대형을 정량화하기 위하여 관심 있는 조직/세포에 NRDP1:USP8 PLA를 사용하는 간단하고 능률적인 접근을 기술합니다. 우리는 이전에 공동 면역 침전 실험, 무세포 상호 작용 연구 및 시험관 내 뿐만 아니라 세포 기지를 둔 몇몇 방법론에 의해 췌장 베타 세포에 있는 CLEC16A-NRDP1-USP8 미토파지 복합체의 대형을 확인했습니다 유비퀴틴 화 검사, 이 복잡한 드라이브가…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 JDRF (CDA-2016-189 및 SRA-2018-539), 당뇨병 및 소화 및 신장 질환의 국립 연구소, 건강의 국립 연구소 (R01-DK-108921), Brehm 가족, 앤서니 가족의 자금 지원을 인정합니다. JDRF 커리어 개발 어워드는 노보 노디스크 재단이 지원하는 덴마크 당뇨병 아카데미의 지원을 받고 있습니다.
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA 1X | Life Technologies | 25200-056 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Block solution | Homemade | Use 1X PBS, add 10 % donkey serum, and 0.3% Triton X-100 detergent. | |
| Buffer A | Homemade | To make 1L: Mix 8.8g NaCl, 1.2g Tris base, 500ul Tween-20, with 750mL ddH20. pH to 7.5 with HCl, and fill to 1L. Filter solution and store at 4C. Bring to RT before experimental use | |
| Buffer B | Homemade | To make 1L: Mix 5.84g NaCl, 4.24g Tris base, 26g Tris-HCl with 500mL ddH20. pH to 7.5, and fill to 1L. Filter solution and store a 4C. Bring to RT before experimental use | |
| Cy5-conjugated AffiniPure donkey anti-goat | Jackson Labs | 705-175-147 | |
| Detection Reagents Red | Sigma- Aldrich | DU092008-100RXN | Kit containing: ligation solution stock (5X), ligase, amplification solution stock (5X) and polymerase. |
| DuoLink PLA probe anti-mouse MINUS | Sigma- Aldrich | DU092004-100RXN | |
| DuoLink PLA probe anti-rabbit PLUS | Sigma- Aldrich | DU092002-100RXN | |
| Fetal bovine serum | |||
| Goat polyclonal anti-PDX1 (clone A17) | Santa Cruz | SC-14664 | RRID: AB_2162373 |
| HEPES (1M) | Life Technologies | 15630-080 | |
| MIN6 pancreatic cell line | Gift from D. Stoffers | Mouse insulinoma cell line, utilized for cell-based assays. | |
| Mouse monoclonal anti-USP8 antibody (clone US872) | Sigma- Aldrich | SAB200527 | |
| Pap-pen | Research Products International | 195505 | |
| Parafilm | Use to seal antibody and probe solutions on your cells to prevent evaporation when using small solution volumes. | ||
| PBT (phosphate buffered saline with triton) | Homemade | To make 50mL: 43.5mLddH2O, 5mL 10X PBS, 0.5mL 10X BSA(100mg/mL solution), 1mL 10% triton X-100 solution in ddH20) | |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline, 10X | Fisher Scientific | BP399-20 | |
| PIM(ABS) Human AB serum | Prodo Labs | PIM-ABS001GMP | |
| PIM(G) (glutamine) | Prodo Labs | PIM-G001GMP | |
| PIM(S) media | Prodo Labs | PIM-S001GMP | |
| PR619 | Apex Bio | A812 | |
| Prolong Gold antifade reagent with DAPI | Life Technologies (Molecular Probes) | P36935 | |
| Rabbit polyclonal anti-FLRF/RNF41 (Nrdp1) | Bethyl Laboratories | A300-049A | RRID: AB_2181251 |
| SH-SY5Y cells | Gift from L. Satin | Human neuroblastoma cell line, utilized for cell-based assays. | |
| Sodium Pyruvate (100X) | Life Technologies | 11360-070 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| Water for RNA work (DEPC water) | Fisher Scientific | BP361-1L |
Referências
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