Visualisering af endogene Mitophagy komplekser in situ i humane bugspytkirtel beta celler udnytte nærhed ligation assay
Summary
Denne protokol skitserer en metode til kvantitativ analyse af mitophagy protein kompleksdannelse specifikt i beta celler fra primære menneskelige ø prøver. Denne teknik giver således mulighed for analyse af mitophagy fra begrænset biologisk materiale, som er afgørende i dyrebare menneskelige bugspytkirtel beta celleprøver.
Abstract
Mitophagy er en vigtig mitokondriel kvalitetskontrol pathway, som er afgørende for bugspytkirtlen ø beta celle bioenergetik til brændstof glukose-stimuleret insulin frigivelse. Vurdering af mitophagy er udfordrende og kræver ofte genetiske journalister eller flere komplementære teknikker, der ikke let udnyttes i vævsprøver, såsom primære menneskelige bugspytkirtel Holme. Her demonstrerer vi en robust tilgang til at visualisere og kvantificere dannelse af vigtige endogene mitophagy komplekser i primære menneskelige pancreas-øer. Udnytte den følsomme nærhed ligering assay teknik til at detektere interaktion af mitophagy regulatorer NRDP1 og USP8, vi er i stand til specifikt kvantificere dannelse af essentielle mitophagy komplekser in situ. Ved at koble denne fremgangsmåde til kontra farvning for transkriptionsfaktoren PDX1, kan vi kvantificere mitophagy komplekser, og de faktorer, der kan forringe mitophagy, specifikt inden for beta celler. Den metode, vi beskriver, overvinder behovet for store mængder af cellulære ekstrakter, der kræves til andre protein-protein interaktionsstudier, såsom immunopræcipitation (IP) eller massespektrometri, og er ideel til dyrebare menneskelige ø prøver generelt ikke rådighed i tilstrækkelige mængder til disse tilgange. Denne metode overfløder endvidere behovet for flow sorterings teknikker til rensning af beta celler fra en heterogen ø-population til downstream-protein anvendelser. Således beskriver vi en værdifuld protokol til visualisering af mitophagy meget kompatibel til brug i heterogene og begrænsede cellepopulationer.
Introduction
Bugspytkirtel beta celler producere insulin kræves for at opretholde normal glukose homøostase, og deres fiasko resulterer i udviklingen af alle former for diabetes. Beta celler bevarer en robust mitokondriel kapacitet til at generere den energi, der kræves for at koble glukose metabolisme med insulin frigivelse. For nylig er det blevet klart, at opretholdelsen af funktionelle mitokondrie masse er af afgørende betydning for optimal beta celle funktion1,2,3. For at opretholde funktionelle mitokondrie masse, beta celler stole på kvalitetskontrolmekanismer til at fjerne dysfunktionelle, beskadiget, eller aldrende mitokondrier4. Vi og andre har tidligere påvist, at beta celler er afhængige af en specialiseret form for mitokondriel omsætning, kaldet mitokondrie autophagy (eller mitophagy), at opretholde mitokondrie kvalitetskontrol i både gnaver og menneskelige Holme1, 2,5. Desværre, der var dog ingen simpel metode til at detektere mitophagy, eller endogent udtrykte mitophagy komponenter, i humane bugspytkirtel beta celler.
Vi har for nylig vist, at upstream regulering af mitophagy i beta celler er afhængig af dannelsen af et protein kompleks bestående af E3 ligases CLEC16A og NRDP1 og deubiquitinase USP81. NRDP1 og USP8 er blevet vist selvstændigt at påvirke mitophagy gennem handling på den centrale mitophagy initiator Parkin6,7. NRDP1 mål PARKIN for allestedsnærværende og nedbrydning at slukke mitophagy6, og USP8 specifikt deubiquitinates K6-forbundet Parkin at fremme sin translokation til mitokondrier7. Nærhed ligering assay (PLA) teknologi har været en nylig fremgang inden for protein interaktion biologi8, tillader visualisering af endogene protein interaktioner in situ i enkeltceller, og er ikke begrænset af knappe prøvemateriale. Denne metode er særligt fristende for menneskelig ø/beta cellebiologi, på grund af den sparsomme prøve tilgængelighed, kombineret med behovet for at forstå fysiologisk relevante protein komplekser inden for heterogene celletyper.
Udnytte PLA tilgang, vi er i stand til at observere vigtige endogene mitophagy komplekser i primære menneskelige bugspytkirtel beta celler og neuronal cellelinjer, og demonstrere virkningerne af en diabetogenic miljø på mitophagy pathway1. Sammenfattende er det overordnede mål med denne protokol at analysere specifikke mitophagy-protein komplekser i væv, der mangler rigeligt materiale, eller hvor konventionelle protein interaktionsundersøgelser ikke er mulige.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskriver vi en enkel og effektiv tilgang til brug af NRDP1: USP8 PLA i væv/celler af interesse for at kvantificere dannelse af opstrøms mitophagy komplekser. Vi har tidligere bekræftet dannelsen af CLEC16A-NRDP1-USP8 mitophagy kompleks i bugspytkirtlen beta celler af flere metoder, herunder Co-immunoprecipitation eksperimenter, celle-fri interaktion undersøgelser, og in vitro samt celle-baserede allestedsnærværende assays, og demonstrerede, hvordan dette komplekse drev regulerede mitophagic flux<sup class="xre…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne anerkender støtte fra JDRF (CDA-2016-189 og SRA-2018-539), National Institute of diabetes og fordøjelses-og nyresygdomme, National Institutes of Health (R01-DK-108921), Brehm-familien og Anthony-familien. JDRF Karriereudviklings prisen til S.A.S. støttes delvist af det danske diabetes akademi, som støttes af Novo Nordisk Fonden.
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA 1X | Life Technologies | 25200-056 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Block solution | Homemade | Use 1X PBS, add 10 % donkey serum, and 0.3% Triton X-100 detergent. | |
| Buffer A | Homemade | To make 1L: Mix 8.8g NaCl, 1.2g Tris base, 500ul Tween-20, with 750mL ddH20. pH to 7.5 with HCl, and fill to 1L. Filter solution and store at 4C. Bring to RT before experimental use | |
| Buffer B | Homemade | To make 1L: Mix 5.84g NaCl, 4.24g Tris base, 26g Tris-HCl with 500mL ddH20. pH to 7.5, and fill to 1L. Filter solution and store a 4C. Bring to RT before experimental use | |
| Cy5-conjugated AffiniPure donkey anti-goat | Jackson Labs | 705-175-147 | |
| Detection Reagents Red | Sigma- Aldrich | DU092008-100RXN | Kit containing: ligation solution stock (5X), ligase, amplification solution stock (5X) and polymerase. |
| DuoLink PLA probe anti-mouse MINUS | Sigma- Aldrich | DU092004-100RXN | |
| DuoLink PLA probe anti-rabbit PLUS | Sigma- Aldrich | DU092002-100RXN | |
| Fetal bovine serum | |||
| Goat polyclonal anti-PDX1 (clone A17) | Santa Cruz | SC-14664 | RRID: AB_2162373 |
| HEPES (1M) | Life Technologies | 15630-080 | |
| MIN6 pancreatic cell line | Gift from D. Stoffers | Mouse insulinoma cell line, utilized for cell-based assays. | |
| Mouse monoclonal anti-USP8 antibody (clone US872) | Sigma- Aldrich | SAB200527 | |
| Pap-pen | Research Products International | 195505 | |
| Parafilm | Use to seal antibody and probe solutions on your cells to prevent evaporation when using small solution volumes. | ||
| PBT (phosphate buffered saline with triton) | Homemade | To make 50mL: 43.5mLddH2O, 5mL 10X PBS, 0.5mL 10X BSA(100mg/mL solution), 1mL 10% triton X-100 solution in ddH20) | |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline, 10X | Fisher Scientific | BP399-20 | |
| PIM(ABS) Human AB serum | Prodo Labs | PIM-ABS001GMP | |
| PIM(G) (glutamine) | Prodo Labs | PIM-G001GMP | |
| PIM(S) media | Prodo Labs | PIM-S001GMP | |
| PR619 | Apex Bio | A812 | |
| Prolong Gold antifade reagent with DAPI | Life Technologies (Molecular Probes) | P36935 | |
| Rabbit polyclonal anti-FLRF/RNF41 (Nrdp1) | Bethyl Laboratories | A300-049A | RRID: AB_2181251 |
| SH-SY5Y cells | Gift from L. Satin | Human neuroblastoma cell line, utilized for cell-based assays. | |
| Sodium Pyruvate (100X) | Life Technologies | 11360-070 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| Water for RNA work (DEPC water) | Fisher Scientific | BP361-1L |
Referências
- Pearson, G., et al. Clec16a, Nrdp1, and USP8 Form a Ubiquitin-Dependent Tripartite Complex That Regulates beta-Cell Mitophagy. Diabetes. 67 (2), 265-277 (2018).
- Soleimanpour, S. A., et al. The diabetes susceptibility gene Clec16a regulates mitophagy. Cell. 157 (7), 1577-1590 (2014).
- Kaufman, B. A., Li, C., Soleimanpour, S. A. Mitochondrial regulation of β-cell function: Maintaining the momentum for insulin release. Molecular Aspects of Medicine. , (2015).
- Hattori, N., Saiki, S., Imai, Y. Regulation by mitophagy. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 53, 147-150 (2014).
- Soleimanpour, S. A., et al. Diabetes Susceptibility Genes Pdx1 and Clec16a Function in a Pathway Regulating Mitophagy in beta-Cells. Diabetes. 64 (10), 3475-3484 (2015).
- Zhong, L., Tan, Y., Zhou, A., Yu, Q., Zhou, J. RING Finger Ubiquitin-Protein Isopeptide Ligase Nrdp1/FLRF Regulates Parkin Stability and Activity. Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 9425-9430 (2005).
- Durcan, T. M., et al. USP8 regulates mitophagy by removing K6-linked ubiquitin conjugates from parkin. The EMBO Journal. 33 (21), 2473-2491 (2014).
- Gauthier, T., Claude-Taupin, A., Delage-Mourroux, R., Boyer-Guittaut, M., Hervouet, E. Proximity Ligation In situ Assay is a Powerful Tool to Monitor Specific ATG Protein Interactions following Autophagy Induction. PLoS ONE. 10 (6), e0128701 (2015).
- Silva Xavier, D. a., G, The Cells of the Islets of Langerhans. Journal of Clinical Medicine. 7 (3), 54 (2018).
- Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. Pancreatic islet plasticity: Interspecies comparison of islet architecture and composition. Islets. 2 (3), 135-145 (2010).
- Cabrera, O., et al. The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (7), 2334 (2006).
- Brissova, M., et al. Assessment of Human Pancreatic Islet Architecture and Composition by Laser Scanning Confocal Microscopy. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (9), 1087-1097 (2005).
- Babu, D. A., Deering, T. G., Mirmira, R. G. A feat of metabolic proportions: Pdx1 orchestrates islet development and function in the maintenance of glucose homeostasis. Molecular Genetics and Metabolism. 92 (1), 43-55 (2007).
- Poitout, V., et al. Glucolipotoxicity of the pancreatic beta cell. Biochimica Biophysica Acta. 1801 (3), 289-298 (2010).
- Pearson, G., Soleimanpour, S. A. A ubiquitin-dependent mitophagy complex maintains mitochondrial function and insulin secretion in beta cells. Autophagy. 14 (7), 1160-1161 (2018).
- Li, J., et al. Single-cell transcriptomes reveal characteristic features of human pancreatic islet cell types. EMBO Reports. 17 (2), 178-187 (2016).
- DiGruccio, M. R., et al. Comprehensive alpha, beta and delta cell transcriptomes reveal that ghrelin selectively activates delta cells and promotes somatostatin release from pancreatic islets. Molecular Metabolism. 5 (7), 449-458 (2016).
- Lawlor, N., et al. Single-cell transcriptomes identify human islet cell signatures and reveal cell-type–specific expression changes in type 2 diabetes. Genome Research. 27 (2), 208-222 (2017).
- Dorrell, C., et al. Human islets contain four distinct subtypes of β cells. Nature Communications. 7, 11756 (2016).
- Dorrell, C., et al. Isolation of major pancreatic cell types and long-term culture-initiating cells using novel human surface markers. Stem Cell Research. 1 (3), 183-194 (2008).
- Jayaraman, S. A novel method for the detection of viable human pancreatic beta cells by flow cytometry using fluorophores that selectively detect labile zinc, mitochondrial membrane potential and protein thiols. Cytometry Part A. 73 (7), 615-625 (2008).
- Arda, H. E., et al. Age-Dependent Pancreatic Gene Regulation Reveals Mechanisms Governing Human ß-Cell Function. Cell Metabolism. 23 (5), 909-920 (2016).
- Allen, G. F. G., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).
- Villa, E., Marchetti, S., Ricci, J. -. E. No Parkin Zone: Mitophagy without Parkin. Trends in Cell Biology. , (2018).
