मानव अग्नाशय बीटा कोशिकाओं में Situ में अंतर्जात Mitophagy परिसरों का दृश्य निकटता लिगेशन परख का उपयोग
Summary
इस प्रोटोकॉल विशेष रूप से प्राथमिक मानव गिलेट के नमूनों से बीटा कोशिकाओं में mitophagy प्रोटीन जटिल गठन के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक विधि की रूपरेखा. इस तकनीक इस प्रकार सीमित जैविक सामग्री है, जो कीमती मानव अग्नाशय बीटा सेल के नमूनों में महत्वपूर्ण हैं से mitophagy के विश्लेषण की अनुमति देता है.
Abstract
Mitophagy एक आवश्यक mitochondrial गुणवत्ता नियंत्रण मार्ग है, जो अग्नाशय ी islet बीटा सेल bioenergetics के लिए ग्लूकोज उत्तेजित इंसुलिन रिलीज ईंधन के लिए महत्वपूर्ण है. mitophagy का आकलन चुनौतीपूर्ण है और अक्सर आनुवंशिक पत्रकारों या कई पूरक तकनीकों की आवश्यकता है आसानी से ऊतक के नमूने में उपयोग नहीं, इस तरह के प्राथमिक मानव अग्नाशय islets के रूप में. यहाँ हम कल्पना और प्राथमिक मानव अग्नाशय islets में कुंजी अंतर्जात mitophagy परिसरों के गठन की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक मजबूत दृष्टिकोण का प्रदर्शन. संवेदनशील निकटता ligation परख तकनीक का उपयोग करने के लिए mitophagy नियामकों NRDP1 और USP8 के संपर्क का पता लगाने के लिए, हम विशेष रूप से situ में आवश्यक mitophagy परिसरों के गठन की मात्रा निर्धारित करने में सक्षम हैं. प्रतिलेखन कारक PDX1 के लिए counterstaining करने के लिए इस दृष्टिकोण युग्मन करके, हम mitophagy परिसरों की मात्रा निर्धारित कर सकते हैं, और कारक है कि mitophagy ख़राब कर सकते हैं, विशेष रूप से बीटा कोशिकाओं के भीतर. पद्धति हम वर्णन सेलुलर अन्य प्रोटीन बातचीत अध्ययन के लिए आवश्यक निष्कर्षों की बड़ी मात्रा के लिए की आवश्यकता पर काबू पाने, ऐसे इम्यूनोप्रीसिप्शन (आईपी) या बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री के रूप में, और कीमती मानव आइलेट नमूने के लिए आदर्श है आम तौर पर नहीं इन दृष्टिकोणों के लिए पर्याप्त मात्रा में उपलब्ध है. इसके अलावा, इस पद्धति प्रवाह छँटाई तकनीक के लिए की जरूरत obviates बहाव प्रोटीन अनुप्रयोगों के लिए एक विषम islet आबादी से बीटा कोशिकाओं को शुद्ध करने के लिए. इस प्रकार, हम विषम और सीमित सेल आबादी में उपयोग के लिए mitophagy अत्यधिक संगत के दृश्य के लिए एक मूल्यवान प्रोटोकॉल का वर्णन.
Introduction
अग्नाशय बीटा कोशिकाओं सामान्य ग्लूकोज homeostasis बनाए रखने के लिए आवश्यक इंसुलिन का उत्पादन, और मधुमेह के सभी रूपों के विकास में उनकी विफलता परिणाम. बीटा कोशिकाओं इंसुलिन रिलीज के साथ जोड़े ग्लूकोज चयापचय के लिए आवश्यक ऊर्जा उत्पन्न करने के लिए एक मजबूत mitochondrial क्षमता बनाए रखने. हाल ही में, यह स्पष्ट हो गया है कि कार्यात्मक माइटोकोंड्रियाल द्रव्यमान का रखरखाव इष्टतम बीटा सेल फलन1,2,3के लिए महत्वपूर्ण महत्व का है। कार्यात्मक mitochondrial द्रव्यमान को बनाए रखने के लिए, बीटा कोशिकाओं बेकार, क्षतिग्रस्त, या उम्र बढ़ने mitochondria4को दूर करने के लिए गुणवत्ता नियंत्रण तंत्र पर भरोसा करते हैं। हम और दूसरों को पहले से पता चला है कि बीटा कोशिकाओं mitochondrial कारोबार के एक विशेष रूप पर भरोसा करते हैं, mitochondrial autophagy कहा जाता है (या mitophagy), दोनों कृंतक और मानव islets में mitochondrial गुणवत्ता नियंत्रण बनाए रखने के लिए1, 2,5. दुर्भाग्य से, तथापि, वहाँ mitophagy का पता लगाने के लिए कोई सरल तरीका था, या अंतर्जात रूप से व्यक्त mitophagy घटकों, मानव अग्नाशय बीटा कोशिकाओं में.
हमने हाल ही में दिखाया है कि बीटा कोशिकाओं में मिटोफैगी का अपस्ट्रीम विनियमन एक प्रोटीन परिसर के गठन पर निर्भर करता है जिसमें E3 ligas CLEC16A और NRDP1 और डेयूबिक्विटिनेस यूएसपी 81शामिल हैं . एनआरडीपी1 और यूएसपी 8 को प्रमुख मिटोफैगी प्रारम्भिक पार्किन6,7पर कार्रवाई के माध्यम से मिटोफैगी को प्रभावित करने के लिए स्वतंत्र रूप से दिखाया गया है . NRDP1 सर्वव्यापकता और गिरावट के लिए PARKIN लक्ष्य mitophagy6बंद करने के लिए , और USP8 विशेष रूप से deubiquitinates K6 से जुड़े PARKIN mitochondria7के लिए अपने स्थानांतरण को बढ़ावा देने के लिए . निकटता लिगेशन परख (पीएलए) प्रौद्योगिकी प्रोटीन बातचीत जीव विज्ञान8के क्षेत्र में हाल ही में एक अग्रिम किया गया है, एकल कोशिकाओं में situ में अंतर्जात प्रोटीन बातचीत के दृश्य की अनुमति है, और दुर्लभ नमूना सामग्री द्वारा सीमित नहीं है. यह पद्धति विशेष रूप से मानव आइलेट/बीटा सेल जीव विज्ञान के लिए मोहक है, नमूना उपलब्धता की कमी के कारण, विषम कोशिका प्रकारों के भीतर शारीरिक रूप से प्रासंगिक प्रोटीन परिसरों को समझने की आवश्यकता के साथ।।
पीएलए दृष्टिकोण का उपयोग, हम प्राथमिक मानव अग्नाशय बीटा कोशिकाओं और न्यूरॉन सेल लाइनों में प्रमुख अंतर्जात mitophagy परिसरों का निरीक्षण करने में सक्षम हैं, और mitophagy मार्ग पर एक diabetogenic पर्यावरण के प्रभाव का प्रदर्शन1. संक्षेप में, इस प्रोटोकॉल के व्यापक लक्ष्य के लिए प्रचुर मात्रा में सामग्री की कमी ऊतकों में विशिष्ट mitophagy प्रोटीन परिसरों का विश्लेषण है, या जहां पारंपरिक प्रोटीन-इंटरैक्शन अध्ययन संभव नहीं हैं.
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ हम NRDP1 का उपयोग करने के लिए एक सरल और कुशल दृष्टिकोण का वर्णन:USP8 पीएलए के ऊतकों में / ब्याज की कोशिकाओं को अपस्ट्रीम mitophagy परिसरों के गठन की मात्रा निर्धारित करने के लिए. हम पहले CLEC16A-NRDP1-USP8 mitophagy परिसर के गठन क?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकJDRF (CDA-2016-189 और SRA-2018-539), राष्ट्रीय मधुमेह और पाचन और गुर्दे की बीमारियों के संस्थान, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (R01-DK-108921), ब्रेहम परिवार, और एंथनी परिवार से धन सहायता स्वीकार करते हैं. S.A.S. को JDRF कैरियर विकास पुरस्कार आंशिक रूप से डेनिश मधुमेह अकादमी, जो नोवो Nordisk फाउंडेशन द्वारा समर्थित है द्वारा समर्थित है.
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA 1X | Life Technologies | 25200-056 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Block solution | Homemade | Use 1X PBS, add 10 % donkey serum, and 0.3% Triton X-100 detergent. | |
| Buffer A | Homemade | To make 1L: Mix 8.8g NaCl, 1.2g Tris base, 500ul Tween-20, with 750mL ddH20. pH to 7.5 with HCl, and fill to 1L. Filter solution and store at 4C. Bring to RT before experimental use | |
| Buffer B | Homemade | To make 1L: Mix 5.84g NaCl, 4.24g Tris base, 26g Tris-HCl with 500mL ddH20. pH to 7.5, and fill to 1L. Filter solution and store a 4C. Bring to RT before experimental use | |
| Cy5-conjugated AffiniPure donkey anti-goat | Jackson Labs | 705-175-147 | |
| Detection Reagents Red | Sigma- Aldrich | DU092008-100RXN | Kit containing: ligation solution stock (5X), ligase, amplification solution stock (5X) and polymerase. |
| DuoLink PLA probe anti-mouse MINUS | Sigma- Aldrich | DU092004-100RXN | |
| DuoLink PLA probe anti-rabbit PLUS | Sigma- Aldrich | DU092002-100RXN | |
| Fetal bovine serum | |||
| Goat polyclonal anti-PDX1 (clone A17) | Santa Cruz | SC-14664 | RRID: AB_2162373 |
| HEPES (1M) | Life Technologies | 15630-080 | |
| MIN6 pancreatic cell line | Gift from D. Stoffers | Mouse insulinoma cell line, utilized for cell-based assays. | |
| Mouse monoclonal anti-USP8 antibody (clone US872) | Sigma- Aldrich | SAB200527 | |
| Pap-pen | Research Products International | 195505 | |
| Parafilm | Use to seal antibody and probe solutions on your cells to prevent evaporation when using small solution volumes. | ||
| PBT (phosphate buffered saline with triton) | Homemade | To make 50mL: 43.5mLddH2O, 5mL 10X PBS, 0.5mL 10X BSA(100mg/mL solution), 1mL 10% triton X-100 solution in ddH20) | |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline, 10X | Fisher Scientific | BP399-20 | |
| PIM(ABS) Human AB serum | Prodo Labs | PIM-ABS001GMP | |
| PIM(G) (glutamine) | Prodo Labs | PIM-G001GMP | |
| PIM(S) media | Prodo Labs | PIM-S001GMP | |
| PR619 | Apex Bio | A812 | |
| Prolong Gold antifade reagent with DAPI | Life Technologies (Molecular Probes) | P36935 | |
| Rabbit polyclonal anti-FLRF/RNF41 (Nrdp1) | Bethyl Laboratories | A300-049A | RRID: AB_2181251 |
| SH-SY5Y cells | Gift from L. Satin | Human neuroblastoma cell line, utilized for cell-based assays. | |
| Sodium Pyruvate (100X) | Life Technologies | 11360-070 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| Water for RNA work (DEPC water) | Fisher Scientific | BP361-1L |
Referências
- Pearson, G., et al. Clec16a, Nrdp1, and USP8 Form a Ubiquitin-Dependent Tripartite Complex That Regulates beta-Cell Mitophagy. Diabetes. 67 (2), 265-277 (2018).
- Soleimanpour, S. A., et al. The diabetes susceptibility gene Clec16a regulates mitophagy. Cell. 157 (7), 1577-1590 (2014).
- Kaufman, B. A., Li, C., Soleimanpour, S. A. Mitochondrial regulation of β-cell function: Maintaining the momentum for insulin release. Molecular Aspects of Medicine. , (2015).
- Hattori, N., Saiki, S., Imai, Y. Regulation by mitophagy. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 53, 147-150 (2014).
- Soleimanpour, S. A., et al. Diabetes Susceptibility Genes Pdx1 and Clec16a Function in a Pathway Regulating Mitophagy in beta-Cells. Diabetes. 64 (10), 3475-3484 (2015).
- Zhong, L., Tan, Y., Zhou, A., Yu, Q., Zhou, J. RING Finger Ubiquitin-Protein Isopeptide Ligase Nrdp1/FLRF Regulates Parkin Stability and Activity. Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 9425-9430 (2005).
- Durcan, T. M., et al. USP8 regulates mitophagy by removing K6-linked ubiquitin conjugates from parkin. The EMBO Journal. 33 (21), 2473-2491 (2014).
- Gauthier, T., Claude-Taupin, A., Delage-Mourroux, R., Boyer-Guittaut, M., Hervouet, E. Proximity Ligation In situ Assay is a Powerful Tool to Monitor Specific ATG Protein Interactions following Autophagy Induction. PLoS ONE. 10 (6), e0128701 (2015).
- Silva Xavier, D. a., G, The Cells of the Islets of Langerhans. Journal of Clinical Medicine. 7 (3), 54 (2018).
- Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. Pancreatic islet plasticity: Interspecies comparison of islet architecture and composition. Islets. 2 (3), 135-145 (2010).
- Cabrera, O., et al. The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (7), 2334 (2006).
- Brissova, M., et al. Assessment of Human Pancreatic Islet Architecture and Composition by Laser Scanning Confocal Microscopy. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (9), 1087-1097 (2005).
- Babu, D. A., Deering, T. G., Mirmira, R. G. A feat of metabolic proportions: Pdx1 orchestrates islet development and function in the maintenance of glucose homeostasis. Molecular Genetics and Metabolism. 92 (1), 43-55 (2007).
- Poitout, V., et al. Glucolipotoxicity of the pancreatic beta cell. Biochimica Biophysica Acta. 1801 (3), 289-298 (2010).
- Pearson, G., Soleimanpour, S. A. A ubiquitin-dependent mitophagy complex maintains mitochondrial function and insulin secretion in beta cells. Autophagy. 14 (7), 1160-1161 (2018).
- Li, J., et al. Single-cell transcriptomes reveal characteristic features of human pancreatic islet cell types. EMBO Reports. 17 (2), 178-187 (2016).
- DiGruccio, M. R., et al. Comprehensive alpha, beta and delta cell transcriptomes reveal that ghrelin selectively activates delta cells and promotes somatostatin release from pancreatic islets. Molecular Metabolism. 5 (7), 449-458 (2016).
- Lawlor, N., et al. Single-cell transcriptomes identify human islet cell signatures and reveal cell-type–specific expression changes in type 2 diabetes. Genome Research. 27 (2), 208-222 (2017).
- Dorrell, C., et al. Human islets contain four distinct subtypes of β cells. Nature Communications. 7, 11756 (2016).
- Dorrell, C., et al. Isolation of major pancreatic cell types and long-term culture-initiating cells using novel human surface markers. Stem Cell Research. 1 (3), 183-194 (2008).
- Jayaraman, S. A novel method for the detection of viable human pancreatic beta cells by flow cytometry using fluorophores that selectively detect labile zinc, mitochondrial membrane potential and protein thiols. Cytometry Part A. 73 (7), 615-625 (2008).
- Arda, H. E., et al. Age-Dependent Pancreatic Gene Regulation Reveals Mechanisms Governing Human ß-Cell Function. Cell Metabolism. 23 (5), 909-920 (2016).
- Allen, G. F. G., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).
- Villa, E., Marchetti, S., Ricci, J. -. E. No Parkin Zone: Mitophagy without Parkin. Trends in Cell Biology. , (2018).
