Visualisering av endogene Mitophagy komplekser in situ i Human bukspyttkjertelen beta Cells utnytte nærhet ligation analysen
Summary
Denne protokollen skisserer en metode for kvantitativ analyse av mitophagy protein kompleks formasjon spesielt i beta celler fra primære menneskelige Holme prøver. Denne teknikken gir dermed analyse av mitophagy fra begrenset biologisk materiale, som er avgjørende i dyrebare menneskelige bukspyttkjertelen beta celleprøver.
Abstract
Mitophagy er en viktig mitokondrie kvalitetskontroll sti, som er avgjørende for bukspyttkjertel beta celle bioenergi til drivstoff glukose-stimulert insulin utgivelse. Vurdering av mitophagy er utfordrende og krever ofte genetiske journalister eller flere komplementære teknikker som ikke er lett å anvende i vevsprøver, slik som primære, menneskelige bukspyttkjertelen. Her viser vi en robust tilnærming for å visualisere og kvantifisere dannelsen av sentrale endogene mitophagy komplekser i primære menneskelige bukspyttkjertelen holmer. Utnytte den følsomme nærhet ligation analysen teknikk for å oppdage samspillet av mitophagy regulatorer NRDP1 og USP8, er vi i stand til å spesifikt kvantifisere dannelsen av essensielle mitophagy komplekser in situ. Ved sammenkobling denne tilnærmingen til counterstaining for transkripsjon faktor PDX1, kan vi kvantifisere mitophagy komplekser, og faktorer som kan svekke mitophagy, spesielt i beta-celler. Metodikken vi beskriver overvinner behovet for store mengder av cellulære ekstrakter som kreves for andre protein-protein interaksjonsstudier, slik som immunutfelling (IP) eller masse massespektrometri, og er ideell for dyrebare menneskelige Holmen prøver generelt ikke tilgjengelig i tilstrekkelige mengder for disse tilnærmingene. Videre, denne metodikken obviates behovet for flyt sortering teknikker for å rense beta celler fra en heterogen Holme befolkning for nedstrøms protein applikasjoner. Derfor beskriver vi en verdifull protokoll for visualisering av mitophagy som er svært kompatibel for bruk i heterogene og begrensede celle populasjoner.
Introduction
Bukspyttkjertelen beta celler produserer insulin som kreves for å opprettholde normal glukose homeostase, og deres svikt resulterer i utviklingen av alle former for diabetes. Beta celler beholde en robust mitokondrie kapasitet til å generere energien som kreves for å par glukose metabolisme med insulin utgivelse. Nylig har det blitt klart at vedlikehold av funksjonell mitokondrie massen er av avgjørende betydning for optimal beta celle funksjon1,2,3. For å opprettholde funksjonell mitokondrie masse, beta celler stole på kvalitetskontroll mekanismer for å fjerne dysfunksjonelle, skadet eller aldrende mitokondrier4. Vi og andre har tidligere vist at beta celler stole på en spesialisert form for mitokondrie omsetning, kalt mitokondrie autofagi (eller mitophagy), for å opprettholde mitokondrie kvalitetskontroll i både gnager og menneskelige holmer1, 2,5. Beklageligvis, imidlertid, der var nei enkel metoden å merker mitophagy, eller endogenously uttrykt mitophagy komponentene, inne human bukspyttkjertelen beta celler.
Vi har nylig vist at oppstrøms regulering av mitophagy i beta celler er avhengig av dannelsen av et protein kompleks bestående av E3 ligases CLEC16A og NRDP1 og deubiquitinase USP81. NRDP1 og USP8 har blitt vist uavhengig å påvirke mitophagy gjennom handling på nøkkelen mitophagy initiator PARKIN6,7. NRDP1 mål PARKIN for ubiqitinering og degradering å skru av mitophagy6, og USP8 spesielt deubiquitinates K6-sammenkoblet PARKIN å fremme dens translokasjon å mitokondrier7. Nærhet ligation analysen (PLA) teknologi har vært en fersk forhånd innen protein interaksjon biologi8, slik visualisering av endogene protein interaksjoner in situ i enkeltceller, og er ikke begrenset av knappe sample materiale. Denne metodikken er spesielt fristende for menneskelig Holme/beta cellebiologi, på grunn av sparsity av prøven tilgjengelighet, koplet til behovet for å forstå fysiologisk relevante protein komplekser innenfor heterogene celletyper.
Utnytte PLA tilnærming, er vi i stand til å observere sentrale endogene mitophagy komplekser i primære menneskelige bukspyttkjertelen beta celler og neuronal cellelinjer, og demonstrere virkningene av et diabetogenic miljø på mitophagy Pathway1. Oppsummert er det overordnede målet med denne protokollen å analysere spesifikke mitophagy protein komplekser i vev som mangler rikelig materiale, eller hvor konvensjonelle protein-interaksjon studier er ikke mulig.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskriver vi en enkel og effektiv tilnærming til bruk NRDP1: USP8 PLA i vev/celler av interesse å kvantifisere dannelsen av oppstrøms mitophagy komplekser. Vi har tidligere bekreftet dannelsen av CLEC16A-NRDP1-USP8 mitophagy kompleks i bukspyttkjertelen beta celler av flere metoder, inkludert co-immunutfelling eksperimenter, celle-frie interaksjonsstudier, og in vitro samt celle-baserte ubiqitinering analyser, og demonstrerte hvordan dette komplekse stasjoner regulert mitophagic Flux1,…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne erkjenner finansiering støtte fra JDRF (CDA-2016-189 og SRA-2018-539), National Institute of diabetes og fordøyelses-og nyre sykdommer, National Institutes of Health (R01-DK-108921), den Brehm familien, og Anthony familien. JDRF karriere utviklings pris til S.A.S. støttes delvis av det danske diabetes akademiet, som støttes av Novo nordisk Foundation.
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA 1X | Life Technologies | 25200-056 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Block solution | Homemade | Use 1X PBS, add 10 % donkey serum, and 0.3% Triton X-100 detergent. | |
| Buffer A | Homemade | To make 1L: Mix 8.8g NaCl, 1.2g Tris base, 500ul Tween-20, with 750mL ddH20. pH to 7.5 with HCl, and fill to 1L. Filter solution and store at 4C. Bring to RT before experimental use | |
| Buffer B | Homemade | To make 1L: Mix 5.84g NaCl, 4.24g Tris base, 26g Tris-HCl with 500mL ddH20. pH to 7.5, and fill to 1L. Filter solution and store a 4C. Bring to RT before experimental use | |
| Cy5-conjugated AffiniPure donkey anti-goat | Jackson Labs | 705-175-147 | |
| Detection Reagents Red | Sigma- Aldrich | DU092008-100RXN | Kit containing: ligation solution stock (5X), ligase, amplification solution stock (5X) and polymerase. |
| DuoLink PLA probe anti-mouse MINUS | Sigma- Aldrich | DU092004-100RXN | |
| DuoLink PLA probe anti-rabbit PLUS | Sigma- Aldrich | DU092002-100RXN | |
| Fetal bovine serum | |||
| Goat polyclonal anti-PDX1 (clone A17) | Santa Cruz | SC-14664 | RRID: AB_2162373 |
| HEPES (1M) | Life Technologies | 15630-080 | |
| MIN6 pancreatic cell line | Gift from D. Stoffers | Mouse insulinoma cell line, utilized for cell-based assays. | |
| Mouse monoclonal anti-USP8 antibody (clone US872) | Sigma- Aldrich | SAB200527 | |
| Pap-pen | Research Products International | 195505 | |
| Parafilm | Use to seal antibody and probe solutions on your cells to prevent evaporation when using small solution volumes. | ||
| PBT (phosphate buffered saline with triton) | Homemade | To make 50mL: 43.5mLddH2O, 5mL 10X PBS, 0.5mL 10X BSA(100mg/mL solution), 1mL 10% triton X-100 solution in ddH20) | |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline, 10X | Fisher Scientific | BP399-20 | |
| PIM(ABS) Human AB serum | Prodo Labs | PIM-ABS001GMP | |
| PIM(G) (glutamine) | Prodo Labs | PIM-G001GMP | |
| PIM(S) media | Prodo Labs | PIM-S001GMP | |
| PR619 | Apex Bio | A812 | |
| Prolong Gold antifade reagent with DAPI | Life Technologies (Molecular Probes) | P36935 | |
| Rabbit polyclonal anti-FLRF/RNF41 (Nrdp1) | Bethyl Laboratories | A300-049A | RRID: AB_2181251 |
| SH-SY5Y cells | Gift from L. Satin | Human neuroblastoma cell line, utilized for cell-based assays. | |
| Sodium Pyruvate (100X) | Life Technologies | 11360-070 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| Water for RNA work (DEPC water) | Fisher Scientific | BP361-1L |
Referências
- Pearson, G., et al. Clec16a, Nrdp1, and USP8 Form a Ubiquitin-Dependent Tripartite Complex That Regulates beta-Cell Mitophagy. Diabetes. 67 (2), 265-277 (2018).
- Soleimanpour, S. A., et al. The diabetes susceptibility gene Clec16a regulates mitophagy. Cell. 157 (7), 1577-1590 (2014).
- Kaufman, B. A., Li, C., Soleimanpour, S. A. Mitochondrial regulation of β-cell function: Maintaining the momentum for insulin release. Molecular Aspects of Medicine. , (2015).
- Hattori, N., Saiki, S., Imai, Y. Regulation by mitophagy. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 53, 147-150 (2014).
- Soleimanpour, S. A., et al. Diabetes Susceptibility Genes Pdx1 and Clec16a Function in a Pathway Regulating Mitophagy in beta-Cells. Diabetes. 64 (10), 3475-3484 (2015).
- Zhong, L., Tan, Y., Zhou, A., Yu, Q., Zhou, J. RING Finger Ubiquitin-Protein Isopeptide Ligase Nrdp1/FLRF Regulates Parkin Stability and Activity. Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 9425-9430 (2005).
- Durcan, T. M., et al. USP8 regulates mitophagy by removing K6-linked ubiquitin conjugates from parkin. The EMBO Journal. 33 (21), 2473-2491 (2014).
- Gauthier, T., Claude-Taupin, A., Delage-Mourroux, R., Boyer-Guittaut, M., Hervouet, E. Proximity Ligation In situ Assay is a Powerful Tool to Monitor Specific ATG Protein Interactions following Autophagy Induction. PLoS ONE. 10 (6), e0128701 (2015).
- Silva Xavier, D. a., G, The Cells of the Islets of Langerhans. Journal of Clinical Medicine. 7 (3), 54 (2018).
- Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. Pancreatic islet plasticity: Interspecies comparison of islet architecture and composition. Islets. 2 (3), 135-145 (2010).
- Cabrera, O., et al. The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (7), 2334 (2006).
- Brissova, M., et al. Assessment of Human Pancreatic Islet Architecture and Composition by Laser Scanning Confocal Microscopy. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (9), 1087-1097 (2005).
- Babu, D. A., Deering, T. G., Mirmira, R. G. A feat of metabolic proportions: Pdx1 orchestrates islet development and function in the maintenance of glucose homeostasis. Molecular Genetics and Metabolism. 92 (1), 43-55 (2007).
- Poitout, V., et al. Glucolipotoxicity of the pancreatic beta cell. Biochimica Biophysica Acta. 1801 (3), 289-298 (2010).
- Pearson, G., Soleimanpour, S. A. A ubiquitin-dependent mitophagy complex maintains mitochondrial function and insulin secretion in beta cells. Autophagy. 14 (7), 1160-1161 (2018).
- Li, J., et al. Single-cell transcriptomes reveal characteristic features of human pancreatic islet cell types. EMBO Reports. 17 (2), 178-187 (2016).
- DiGruccio, M. R., et al. Comprehensive alpha, beta and delta cell transcriptomes reveal that ghrelin selectively activates delta cells and promotes somatostatin release from pancreatic islets. Molecular Metabolism. 5 (7), 449-458 (2016).
- Lawlor, N., et al. Single-cell transcriptomes identify human islet cell signatures and reveal cell-type–specific expression changes in type 2 diabetes. Genome Research. 27 (2), 208-222 (2017).
- Dorrell, C., et al. Human islets contain four distinct subtypes of β cells. Nature Communications. 7, 11756 (2016).
- Dorrell, C., et al. Isolation of major pancreatic cell types and long-term culture-initiating cells using novel human surface markers. Stem Cell Research. 1 (3), 183-194 (2008).
- Jayaraman, S. A novel method for the detection of viable human pancreatic beta cells by flow cytometry using fluorophores that selectively detect labile zinc, mitochondrial membrane potential and protein thiols. Cytometry Part A. 73 (7), 615-625 (2008).
- Arda, H. E., et al. Age-Dependent Pancreatic Gene Regulation Reveals Mechanisms Governing Human ß-Cell Function. Cell Metabolism. 23 (5), 909-920 (2016).
- Allen, G. F. G., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).
- Villa, E., Marchetti, S., Ricci, J. -. E. No Parkin Zone: Mitophagy without Parkin. Trends in Cell Biology. , (2018).
