लाइव इमेजिंग और Drosophila भ्रूण में मांसपेशी संकुचन का विश्लेषण
Summary
यहाँ, हम एक गैर इनवेसिव और विस्तार उन्मुख तरीके से Drosophila भ्रूण में भ्रूण मांसपेशियों के संकुचन रिकॉर्ड करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
समन्वित मांसपेशी संकुचन लयबद्ध व्यवहार का एक रूप है जो ड्रोसोफिला भ्रूण में विकास के दौरान जल्दी देखा जाता है। न्यूरोनल संवेदी प्रतिक्रिया सर्किट इस व्यवहार को नियंत्रित करने के लिए आवश्यक हैं. संकुचन के लयबद्ध पैटर्न का उत्पादन करने में विफलता तंत्रिका संबंधी असामान्यताओं का संकेत हो सकता है। हमने पहले पाया है कि प्रोटीन ओ-मैनोसिलेशन में दोष, एक posttranslational प्रोटीन संशोधन, संवेदी न्यूरॉन्स के एक्सॉन आकारिकी को प्रभावित और भ्रूण में असामान्य समन्वित मांसपेशियों में संकुचन में परिणाम. यहाँ, हम रिकॉर्डिंग और देर से चरण भ्रूण के लाइव इमेजिंग द्वारा peristaltic मांसपेशियों के संकुचन के पैटर्न का विश्लेषण करने के लिए एक अपेक्षाकृत सरल विधि प्रस्तुत करने के लिए hatching के बिंदु तक, जो हम प्रोटीन की मांसपेशियों के संकुचन phenotype की विशेषता के लिए इस्तेमाल किया हे-मनोसिल्ट्रान्सेस म्यूटेंट्स। इन रिकॉर्डिंग से प्राप्त डेटा आवृत्ति सहित मांसपेशियों में संकुचन तरंगों का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, प्रसार की दिशा और विभिन्न शरीर क्षेत्रों में मांसपेशियों के संकुचन के रिश्तेदार आयाम. हम भी शरीर की मुद्रा की जांच की है और एक फ्लोरोसेंट मार्कर मांसपेशियों में विशेष रूप से व्यक्त करने के लिए सही भ्रूण midline की स्थिति का निर्धारण का लाभ उठाया. इसी तरह के दृष्टिकोण भी इस तरह के भ्रूण रोलिंग और hatching के रूप में विकास के दौरान विभिन्न अन्य व्यवहार का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है।
Introduction
पेरिस्टेलटिक मांसपेशियों में संकुचन एक लयबद्ध मोटर व्यवहार है जो मनुष्यों में चलने और तैराकी के समान होता है1,2,3. Drosophila देर से चरण भ्रूण में देखा भ्रूण मांसपेशियों में संकुचन इस तरह के एक व्यवहार का एक उदाहरण का प्रतिनिधित्व करते हैं। Drosophila विभिन्न विकासात्मक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल जीव है क्योंकि Drosophila में भ्रूण विकास अच्छी तरह से विशेषता है, अपेक्षाकृत कम है, और निगरानी करने के लिए आसान. हमारी विधि के समग्र लक्ष्य को ध्यान से रिकॉर्ड और संकुचन और भ्रूण की मांसपेशियों की छूट की लहर की तरह पैटर्न का विश्लेषण है. हम एक विस्तृत दृश्य प्रदान करता है कि एक सरल, गैर इनवेसिव दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया, रिकॉर्डिंग और मांसपेशियों के संकुचन का विश्लेषण. इस विधि को भी संभावित रूप से vivo प्रक्रियाओं में अन्य अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, इस तरह के भ्रूण रोलिंग के रूप में देर से चरण भ्रूण में देखा बस से पहले hatching. पिछले अध्ययनों में भ्रूणीय मांसपेशी के संकुचन का अधिकतर विश्लेषण आवृत्ति तथा दिशा1,2के संदर्भ में किया जाता था . आदेश में संकुचन के सापेक्ष हद तक अनुमान के रूप में वे पूर्वकाल या पीछे की दिशा में शरीर अक्ष के साथ प्रगति, हम विशेष रूप से मांसपेशियों में GFP व्यक्त भ्रूण का इस्तेमाल किया है. यह विश्लेषण मांसपेशियों के संकुचन का विश्लेषण करने के लिए और पता चलता है कि कैसे भ्रूण में शरीर की मुद्रा मांसपेशियों के संकुचन की peristaltic तरंगों की श्रृंखला के दौरान बनाए रखा है एक अधिक मात्रात्मक तरीका प्रदान करता है.
Peristaltic मांसपेशियों में संकुचन केंद्रीय पैटर्न जनरेटर (CPG) सर्किट और परिधीय तंत्रिका तंत्र के न्यूरॉन्स के बीच संचार द्वारा नियंत्रित कर रहे हैं (पीएनएस), केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस), और मांसपेशियों4,5. सामान्य peristaltic मांसपेशियों के संकुचन का उत्पादन करने में विफलता इस तरह के 2 और असामान्य लार्वा चलन6 हैच करने के लिए विफलता के रूप में दोष के लिए नेतृत्व कर सकते हैं और तंत्रिका संबंधी असामान्यताओं का संकेत हो सकता है। मांसपेशियों के संकुचन और संकुचन phenotypes के विस्तृत विश्लेषण के peristaltic तरंगों के लाइव इमेजिंग मांसपेशियों और चलन में शामिल तंत्रिका सर्किट को प्रभावित आनुवंशिक दोषों के साथ जुड़े रोगजनक तंत्र को उजागर करने में मदद कर सकते हैं। हमने हाल ही में उस दृष्टिकोण का उपयोग ऐसे तंत्रों की जांच करने के लिए किया है जिसके परिणामस्वरूप शरीर की मुद्रा में मरोड़ हो जाता है , पोटिन ओ–एमएनोससिलटीरैनस्फेरेस (पीओएमटी) म्यूटेंट7.
प्रोटीन ओ-मैनोसिलेशन (पोम) एक विशेष प्रकार का पोस्टट्रांसल संशोधन है, जहां एक मैनोस चीनी को स्रावपथप्रोटीन 8,9के सेरीन या थ्रियोनिन अवशेषों में जोड़ा जाता है। पोम में आनुवंशिक दोष के कारण मनुष्यों में जन्मजात पेशीय अपस्थीश (सीएमडी )10,11,12. हम एक मॉडल प्रणाली के रूप में Drosophila का उपयोग कर इन रोगों के कारक तंत्र की जांच की. हमने पाया कि ड्रोसोफिला प्रोटीन ओ-मैनोसिलट्रांसफरस जीन पोमटी1 और पोमटी2 (उर्फ घुमा हुआ पेट ( आरटी) और मुड़ (ट्वी) में उत्परिवर्तन के साथ भ्रूण एक दिखाते हैं शरीर के खंडों का विस्थापन (“रोटेशन”) जिसके परिणामस्वरूप शरीर की असामान्य मुद्रा7होती है। दिलचस्प बात यह है कि यह दोष विकास की अवस्था के साथ हुआ जब peristaltic मांसपेशियों में संकुचन प्रमुख7हो जाते हैं.
चूंकि पोम उत्परिवर्ती भ्रूण में असामान्य शरीर मुद्रा तब उत्पन्न होती है जब पेशी और बाह्य त्वचा पहले से ही बनती है और समन्वित मांसपेशियों के संकुचन की peristaltic तरंगों शुरू कर दिया है, हम hypothesized कि असामान्य शरीर मुद्रा असामान्य मांसपेशियों का एक परिणाम हो सकता है संकुचन मांसपेशियों में दोष के बजाय या / और बाह्य आकृति विज्ञान7. सीएमडी असामान्य मांसपेशियों के संकुचन और मुद्रा दोष13के साथ जुड़ा हो सकता है , और इस प्रकार Drosophila POMT उत्परिवर्ती में आसन phenotype के विश्लेषण मांसपेशियों dystrophies के साथ जुड़े रोग तंत्र स्पष्ट कर सकते हैं . आदेश में Drosophila POMT म्यूटेंट और मांसपेशियों में संकुचन के peristaltic तरंगों में संभावित असामान्यताओं के शरीर मुद्रा phenotype के बीच संबंध की जांच करने के लिए, हम एक जीवित का उपयोग कर विस्तार से मांसपेशियों के संकुचन का विश्लेषण करने का फैसला किया इमेजिंग दृष्टिकोण.
Drosophila भ्रूण में peristaltic संकुचन तरंगों के हमारे विश्लेषण दो अलग संकुचन मोड, प्रकार 1 और प्रकार के रूप में नामित पता चला 2 तरंगों. प्रकार 1 तरंगों सरल तरंगों पूर्वकाल से पीछे या इसके विपरीत करने के लिए प्रचार कर रहे हैं। प्रकार 2 तरंगों biphasic तरंगों है कि पूर्वकाल के अंत में आरंभ कर रहे हैं, पीछे की दिशा में आधे रास्ते का प्रचार, क्षण भर में रोक, एक अस्थायी स्थिर संकुचन बनाने, और फिर, दूसरे चरण के दौरान, एक peristaltic संकुचन है कि प्रचार द्वारा बह रहे हैं पीछे के अंत से आगे. जंगली प्रकार भ्रूण आम तौर पर संकुचन की एक श्रृंखला है कि लगभग 75% प्रकार के होते हैं उत्पन्न 1 और 25% प्रकार 2 तरंगों. इसके विपरीत, POMT उत्परिवर्ती भ्रूण प्रकार उत्पन्न 1 और टाइप 2 तरंगों लगभग बराबर रिश्तेदार आवृत्तियों पर.
हमारा दृष्टिकोण मांसपेशियों के संकुचन और भ्रूण रोलिंग7के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए विस्तृत जानकारी प्रदान कर सकता है . इस दृष्टिकोण को मांसपेशियों में संकुचन से जुड़े अन्य व्यवहारों के विश्लेषण के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है, जैसे कि हैचिंग और रेंगने।
Protocol
Representative Results
Discussion
हमारी विधि विकास के दौरान महत्वपूर्ण भ्रूण व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए एक मात्रात्मक तरीका प्रदान करता है, जैसे कि तरंग आवर्तता, आयाम और पैटर्न सहित peristaltic मांसपेशियों में संकुचन तरंगों, साथ ही भ्रू?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस परियोजना को राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान संस्थान आरओ 1 एनएस099409, एनएस075534 और कॉनैसाइट 2012-037(एस) द्वारा वीपी को सहायता प्रदान की गई थी।
Materials
| Digital camera | Hamamatsu CMOS ORCA-Flash 4.0 | C13440-20CU | With different emission filters |
| Forceps | FST Dumont | 11254-20 | Tip Dimensions 0.05 mm x 0.01 mm |
| LED | X-cite BDX (Excelitas) | XLED1 | |
| Microscope | Carl Ziess Examiner D1 | 491405-0005-000 | Epiflourescence with time lapse |
| Needle | BD | 305767 | 25 G x 1-1/2 in |
| Paintbrush | Contemporary crafts | Any paintbrush will work | |
| Petri dishes | VWR | 25384-164 | 60 mm x 15 mm |
| Software | HCImage Live | ||
| Thread Zap Wax pen | Thread Zap II (by BeadSmith)(Amazon) | TZ1300 | Burner Tool |
| Tricorner plastic beaker | VWR | 25384-152 | 100 mL |
Referências
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