Levande avbildning och analys av muskelsammandragningar i Drosophila embryo
Summary
Här presenterar vi en metod för att registrera embryonala muskelsammandragningar i Drosophila embryon i en icke-invasiv och detalj-orienterad sätt.
Abstract
Koordinerade muskelsammandragningar är en form av rytmisk beteende som setts tidigt under utvecklingen i Drosophila embryon. Neuronala sensoriska återkoppling kretsar krävs för att kontrollera detta beteende. Underlåtenhet att producera det rytmiska mönstret av sammandragningar kan tyda på neurologiska avvikelser. Vi fann tidigare att defekter i protein O-mannosylation, en posttranslationell proteinmodifiering, påverkar axonmorfologin hos sensoriska neuroner och resultera i onormala koordinerade muskelsammandragningar hos embryon. Här presenterar vi en relativt enkel metod för att registrera och analysera mönstret av peristaltiska muskelsammandragningar genom levande avbildning av sena stadier embryon fram till den punkt av kläckning, som vi brukade karakterisera muskelkontraktion fenotyp av protein O-mannosyltransferas mutanter. Data som erhålls från dessa inspelningar kan användas för att analysera muskelkontraktion vågor, inklusive frekvens, spridnings riktning och relativ amplitud av muskelsammandragningar på olika kropps segment. Vi har också undersökt kroppshållning och utnyttjat en fluorescerande markör som uttrycks specifikt i muskler för att exakt bestämma positionen för embryot mittlinjen. Ett liknande tillvägagångssätt kan också utnyttjas för att studera olika andra beteenden under utveckling, såsom embryo rullande och kläckning.
Introduction
Peristaltisk muskelkontraktion är en rytmisk motorisk beteende som liknar promenader och simning i människor1,2,3. Embryonala muskelsammandragningar ses i Drosophila sena stadiet embryon utgör ett exempel på ett sådant beteende. Drosophila är en utmärkt modellorganism för att studera olika utvecklingsprocesser eftersom embryonal utveckling i Drosophila är väl karaktäriserad, relativt kort, och lätt att övervaka. Det övergripande målet med vår metod är att noggrant registrera och analysera vågliknande mönster av kontraktion och avslappning av embryonala muskler. Vi använde en enkel, icke-invasiv metod som erbjuder en detaljerad visualisering, registrering och analys av muskelsammandragningar. Denna metod kan också potentiellt användas för att studera andra in vivo-processer, såsom embryonal rullande ses i sena stadiet embryon strax före kläckningen. I tidigare studier, embryonala muskelsammandragningar analyserades mestadels i termer av frekvens och riktning1,2. För att uppskatta den relativa omfattningen av sammandragningar som de framsteg längs kroppen axeln i främre eller bakre riktning, vi har använt embryon som uttrycker GFP specifikt i muskler. Denna analys ger ett mer kvantitativt sätt att analysera muskelsammandragningar och att avslöja hur kroppshållning i embryon upprätthålls under serie av peristaltiska vågor av muskelsammandragningar.
Peristaltiska muskelsammandragningar styrs av centrala mönster Generator (CPG) kretsar och kommunikation mellan nervceller i det perifera nervsystemet (PNS), det centralanervsystemet (CNS), och muskler4,5. Underlåtenhet att producera normala peristaltiska muskelsammandragningar kan leda till defekter såsom underlåtenhet att kläcka2 och onormal larv förflyttning6 och kan tyda på neurologiska avvikelser. Levande avbildning av peristaltiska vågor av muskelkontraktion och detaljerad analys av kontraktion fenotyper kan hjälpa avslöja patogena mekanismer i samband med genetiska defekter som påverkar muskler och neurala kretsar inblandade i förflyttning. Vi använde nyligen denna metod för att undersöka mekanismer som resulterar i en kroppshållning vridning fenotyp av pprotein O–mannosyltransferase (pomt) mutanter7.
Protein O-mannosylation (POM) är en speciell typ av posttranslationell modifiering, där ett mannos-socker tillsätts till serin-eller treoninrester av sekretoriska väg proteiner8,9. Genetiska defekter i POM orsaka medfödda muskeldystrophies (CMD) hos människor10,11,12. Vi undersökte de orsakande mekanismerna hos dessa sjukdomar med hjälp av Drosophila som modellsystem. Vi fann att embryon med mutationer i Drosophila protein O-mannosyltransferase gener POMT1 och POMT2 (alias roterad buk (RT) och twisted (TW)) visar en förskjutning (“rotation”) av kropps segment, vilket resulterar i en onormal kroppshållning7. Intressant, detta fel sammanföll med utvecklingsstadiet när peristaltiska muskelsammandragningar blir framträdande7.
Eftersom onormal kroppshållning i POM muterade embryon uppstår när muskulatur och epidermis redan bildas och peristaltiska vågor av samordnade muskelsammandragningar har börjat, vi hypotesen att onormal kroppshållning kan vara ett resultat av onormal muskel sammandragningar snarare än en defekt i muskler eller/och epidermis morfologi7. CMDs kan associeras med onormala muskelsammandragningar och kroppshållning defekter13, och därmed analysen av hållning fenotyp i Drosophila pomt mutanter kan belysa patologiska mekanismer i samband med muskeldystrofi . För att undersöka sambandet mellan kroppshållning fenotyp av Drosophila pomt mutanter och eventuella avvikelser i peristaltiska vågor av muskelsammandragningar, bestämde vi oss för att analysera muskelsammandragningar i detalj med hjälp av en levande Imaging-metoden.
Vår analys av peristaltiska kontraktion vågor i Drosophila embryon avslöjade två distinkta kontraktion lägen, betecknas som typ 1 och typ 2 vågor. Typ 1 vågor är enkla vågor förökningsmaterial från Anterior till posteriort eller vice versa. Typ 2 vågor är BiPhasic vågor som initierar vid den främre änden, propagera halvvägs i den bakre riktningen, tillfälligt stanna, bildar en temporal statisk kontraktion, och sedan, under den andra fasen, sveps av en peristaltisk kontraktion som propagerar framåt från den bakre änden. Vildtyp embryon genererar normalt en serie av sammandragningar som består av cirka 75% typ 1 och 25% typ 2 vågor. Pomt Mutant embryon genererar däremot typ 1-och typ 2-vågor vid ungefär lika relativa frekvenser.
Vårt tillvägagångssätt kan ge detaljerad information för kvantitativ analys av muskelsammandragningar och embryo rullande7. Detta tillvägagångssätt kan också anpassas för analyser av andra beteenden som involverar muskelsammandragningar, såsom kläckning och genomsökning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vår metod ger ett kvantitativt sätt att analysera viktiga embryobeteenden under utveckling, såsom peristaltiska muskelkontraktion vågor, inklusive vågperiodicitet, amplitud och mönster, samt våg effekt på embryots rullande och kroppshållning. Detta kan vara användbart i analyser av olika mutanter för att studera betydelsen av specifika gener i regleringen av dessa och andra beteenden under embryonal utveckling. Vi har använt förändringar i muskelspecifika GFP markör intensitet för att analysera muskelkont…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Projektet stöddes delvis av National Institutes of Health Grants RO1 NS099409, NS075534, och CONACYT 2012-037 (S) till VP.
Materials
| Digital camera | Hamamatsu CMOS ORCA-Flash 4.0 | C13440-20CU | With different emission filters |
| Forceps | FST Dumont | 11254-20 | Tip Dimensions 0.05 mm x 0.01 mm |
| LED | X-cite BDX (Excelitas) | XLED1 | |
| Microscope | Carl Ziess Examiner D1 | 491405-0005-000 | Epiflourescence with time lapse |
| Needle | BD | 305767 | 25 G x 1-1/2 in |
| Paintbrush | Contemporary crafts | Any paintbrush will work | |
| Petri dishes | VWR | 25384-164 | 60 mm x 15 mm |
| Software | HCImage Live | ||
| Thread Zap Wax pen | Thread Zap II (by BeadSmith)(Amazon) | TZ1300 | Burner Tool |
| Tricorner plastic beaker | VWR | 25384-152 | 100 mL |
Referências
- Pereanu, W., Spindler, S., Im, E., Buu, N., Hartenstein, V. The emergence of patterned movement during late embryogenesis of Drosophila. Developmental Neurobiology. 67, 1669-1685 (2007).
- Suster, M. L., Bate, M. Embryonic assembly of a central pattern generator without sensory input. Nature. 416, 174-178 (2002).
- Crisp, S., Evers, J. F., Fiala, A., Bate, M. The development of motor coordination in Drosophila embryos. Development. 135, 3707-3717 (2008).
- Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae. Proceedings of National Academy of Science of the United States of America. 104, 5199-5204 (2007).
- Hughes, C. L., Thomas, J. B. A sensory feedback circuit coordinates muscle activity in Drosophila. Molecular and Cellular Neuroscience. 35, 383-396 (2007).
- Gorczyca, D. A., et al. Identification of Ppk26, a DEG/ENaC channel functioning with Ppk1 in a mutually dependent manner to guide locomotion behavior in Drosophila. Cell Reports. 9, 1446-1458 (2014).
- Baker, R., Nakamura, N., Chandel, I., et al. Protein O-Mannosyltransferases affect sensory axon wiring and dynamic chirality of body posture in the Drosophila embryo. Journal of Neuroscience. 38 (7), 1850-1865 (2018).
- Nakamura, N., Lyalin, D., Panin, V. M. Protein O-mannosylation in animal development and physiology: From human Disorders to Drosophila phenotypes. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21, 622-630 (2010).
- Lyalin, D., et al. The twisted gene encodes Drosophila protein O-mannosyltransferase 2 and genetically interacts with the rotated abdomen gene encoding Drosophila protein O-mannosyltransferase 1. Genética. 172, 343-353 (2006).
- Beltrán-Valero de Bernabe, D., et al. Mutations in the O-Mannosyltransferase gene POMT1 give rise to the severe neuronal migration disorder Walker-Warburg Syndrome. American Journal of Human Genetics. 71, 1033-1043 (2002).
- Reeuwijk, J., et al. POMT2 mutations cause alpha-dystroglycan hypoglycosylation and Walker-Warburg syndrome. Journal of Medical Genetics. 42, 907-912 (2005).
- Jaeken, J., Matthijs, G. Congenital disorders of glycosylation: A rapidly expanding disease family. Annual Reviews of Genomics and Human Genetics. 8, 261-278 (2007).
- Leyten, Q. H., Gabreels, F. J., Renier, W. O., ter Laak, H. J. Congenital muscular dystrophy: a review of the literature. Clinical and Neurological Neurosurgery. 98 (4), 267-280 (1996).
- Roberts, D. B., Hames, B. D. Drosophila: A Practical Approach. 2nd ed. The Practical Approach Series. , 389 (1998).
- Heckscher, E. S., et al. Even-Skipped+ interneurons are core components of a sensorimotor circuit that maintains left-right symmetric muscle contraction amplitude. Neuron. 88, 314-329 (2015).
- Penjweini, R., et al. Long-term monitoring of live cell proliferation in presence of PVP-Hypericin: a new strategy using ms pulses of LED and the fluorescent dye CFSE. J. Microscopy. 245, 100-108 (2011).
