क्रोमोजेनिक में सीटू हाइब्रिडाइजेशन एचपीवी से संबंधित सिर और गर्दन कैंसर निदान के लिए एक उपकरण एस
Summary
मानव पेपिलोमावायरस (एचपीवी) आरएनए क्रोमोजेनिक सीटू संकरीकरण में ट्यूमर के भीतर सक्रिय मानव पेपिलोमावायरस संक्रमण का पता लगाने के लिए सोने के मानकों में से एक माना जाता है। यह स्थानीयकरण और अपने संकेत के अर्द्धमात्रागत मूल्यांकन के साथ एचपीवी E6-E7 MRNA अभिव्यक्ति के दृश्य की अनुमति देता है.
Abstract
मानव पेपिलोमावायरस (एचपीवी) संक्रमण ओरोफैरिनियल स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा (ओपीएससी) के उपप्रकार के लिए एक प्रमुख जोखिम कारक है, जो शराब और तंबाकू से संबंधित OPSCC की तुलना में बेहतर परिणाम के साथ जुड़ा हुआ हो जाता है। एचपीवी वायरल आरएनए के सिटू हाइब्रिडाइजेशन (सीएसएच) में क्रोमोजेनिक ऑनकोजेनिक प्रोटीन E6 और E7 के वायरल टेप के अर्द्धमात्रात्मक मूल्यांकन और एक अच्छा स्थानिक संकल्प के साथ एक इनसीटू दृश्य की अनुमति दे सकता है। इस तकनीक ट्यूमरएचपी-संक्रमित कोशिकाओं में एचपीवी प्रतिलेखन के दृश्य के साथ एक सक्रिय संक्रमण के निदान की अनुमति देता है। इस तकनीक का एक लाभ ट्यूमर के निकट nonneoplastic एचपीवी संक्रमित कोशिकाओं से संदूषण से बचने है। कुल मिलाकर, अपने अच्छे निदान प्रदर्शन यह सक्रिय एचपीवी संक्रमण पहचान के लिए सोने के मानक माना जाता है. चूंकि सेल प्रोटीन pRb और p53 के साथ E6 और E7 वायरल प्रोटीन बातचीत सेल परिवर्तन के लिए अनिवार्य है, एचपीवी आरएनए सीआईएच कार्यात्मक रूप से प्रासंगिक है और तीव्रता से सक्रिय oncogenic एचपीवी संक्रमण को दर्शाता है। इस तकनीक के रूप में अच्छी तरह से नैदानिक रूप से प्रासंगिक है के बाद से “कम” या “उच्च” एचपीवी प्रतिलेखन के स्तर एचपीवी से संबंधित p16-सकारात्मक सिर और गर्दन के कैंसर के रोगियों के बीच दो रोग का रोग का पता चलता है समूहों की पहचान में मदद की. यहाँ हम मैनुअल एचपीवी आरएनए CISH के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत formalin-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड (FFPE) स्लाइड पर निर्माता से प्राप्त एक किट के साथ प्रदर्शन किया. क्रोमोजेनिक रहस्योद्घाटन के बजाय, situ संकरीकरण में आरएनए भी फ्लोरोसेंट रहस्योद्घाटन (RNA FISH) के साथ किया जा सकता है। यह भी पारंपरिक इम्यूनोस्टेनिंग के साथ जोड़ा जा सकता है।
Introduction
एचपीवी आरएनए सीएसएच सक्रिय एचपीवी संक्रमण का पता लगाने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है, जो ओरोफैरिनक्स या गर्भाशय ग्रीवा जैसे विभिन्न स्थानों में सौम्य या घातक घावों में महत्वपूर्ण साबित हो सकता है। एक सक्रिय एचपीवी संक्रमण का पता लगाने से एचपीवी प्रेरित घाव के निदान का समर्थन हो सकता है और, जिससे, इसके उपचार और पूर्वानुमान को प्रभावित करते हैं।
एचपीवी सबसे अक्सर यौन संचारित संक्रमण है, और 100 से अधिक वायरल जीनोटाइप का वर्णन किया गया है1. Schematicly, कम जोखिम वाले जीनोटाइप जैसे जीनोटाइप 6 और 11 जननांग मौसा, आवर्तक श्वसन पेपिलोमैटोसिस, और अन्य सौम्य घावों को प्रेरित करने के लिए जाना जाता है, जबकि उच्च जोखिम वाले जीनोटाइप जैसे जीनोटाइप 16 और भी 18 अधिकांश गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर के लिए जिम्मेदार हैं और गुदा कैंसर और क्षेत्रीय महामारी विज्ञान के आंकड़ों2के कारण के रूप में चर अनुपात में hnSCC oncogenesis में एक भूमिका निभाते हैं .
कई उपकरण एचपीवी संक्रमण का पता लगाने के लिए उपलब्ध हैं। एक उच्च जोखिम एचपीवी संक्रमण के रूप में वायरल oncogenic प्रोटीन E6 और E73की अभिव्यक्ति की ओर जाता है , E6 और E7 प्रतिलिपि का पता लगाने व्यापक रूप से सक्रिय एचपीवी संक्रमण पहचान4के लिए सोने के मानक के रूप में देखा जाता है . एचपीवी आरएनए सीएसएच एफएफई नमूनों पर किया जा सकता है जो विभिन्न एचपीवी से संबंधित बीमारियों से पीड़ित रोगियों से आसानी से प्राप्त किए जाते हैं। इसके प्रदर्शन गर्भाशय ग्रीवा में स्क्वैमस इंट्राएपिथील नियोप्लासिया में मूल्यांकन किया गया है, गुदा, और योनि, और गर्भाशय ग्रीवा में आक्रामक स्क्वैमससेल कार्सिनोमा में, गुदा, और ऊपरी एयरो पाचन पथ 5: यह 98% से अधिक की संवेदनशीलता को प्राप्त करता है एचपीवी डीएनए पॉलिमरेज चेन रिएक्शन (पीसीआर)-सकारात्मक मामलों के बीच। यह p16 इम्यूनोस्टेनिंग (93%) की तुलना में थोड़ा बेहतर है और situ संकरीकरण में एचपीवी डीएनए (डीएनए ISH: 97%), जो अधिक सामान्यतः उपयोग किया जाता है. सिर और गर्दन क्षेत्र से उत्पन्न होने वाले स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा (एससीसी) के साथ 57 रोगियों के एक अन्य सहगण में, जननांग क्षेत्र, त्वचा, और मूत्र पथ, एचपीवी डीएनए ISH की तुलना में, एचपीवी आरएनए सीएसएच ने बेहतर संवेदनशीलता हासिल की (100% बनाम 88%) और विशिष्टता (87% बनाम 74%)6|
P16 इम्यूनोस्टेनिंग एक अप्रत्यक्ष मार्कर है जो कोशिका चक्र व्यवधान को दर्शाती है जो एचपीवी संक्रमण4,7द्वारा (लेकिन विशेष रूप से नहीं) के कारण हो सकता है । इस लागत प्रभावी परीक्षण अच्छी संवेदनशीलता और एक नकारात्मक भविष्य कहनेवाला मूल्य के पास है और oropharynx कैंसर में उच्च जोखिम एचपीवी संक्रमण के एक किराए मार्कर के रूप में सिफारिश की है (OPC) अमेरिकी पैथोलॉजिस्ट के कॉलेज द्वारा (कैप) और अंतरराष्ट्रीय के लिए संघ द्वारा कैंसर नियंत्रण (UICC)8|
हालांकि यह पत्र पूरी तरह से एचएनएससीसी में एचपीवी का पता लगाने पर केंद्रित है, एचपीवी आरएनए सीआईएच विभिन्न अन्य स्थितियों में नैदानिक रूप से प्रासंगिक है जिसमें एचपीवी संक्रमण शामिल है। उदाहरण के लिए, इस तकनीक गर्भाशय ग्रीवा के कम ग्रेड स्क्वैमस इंट्राएपिथेलियल घावों के निदान की सटीकता में सुधार हो सकता है (LSIL, पूर्व में गर्भाशय ग्रीवा intraepithelial neoplasia के रूप में जाना जाता है, ग्रेड 1 [CIN1]) रूपात्मक अस्पष्ट मामलों के लिए9. ओरोफैरिनल एससीसी के बारे में, एचपीवी आरएनए सीएसी एच पी वी से संबंधित एससीसी की पहचान की अनुमति देता है, जो हेड और नेक कैंसर के टीएनएम वर्गीकरण के हाल के आठवें संस्करण में एचपीवी-असंबंधित ओरोफैरिनल एससीसी से अलग के रूप में लेबल किया गया है (अंतर्राष्ट्रीय कैंसर के लिए संघ की) नियंत्रण [UICC])10| चूंकि एचपीवी से संबंधित एससीसी एचपीवी से अधिक जीवित रहने और उन्नत रेडियोथेरेपी और कीमोथेरेपी संवेदनशीलता के साथ एक बेहतर पूर्वानुमान दर्शाती है, क्योंकि एचपीवी-असंबंधित एससीसी11,12,13, एचपीवी संक्रमण का पता लगाने से प्रभाव पड़ सकता है रोगी प्रबंधन14,15. इसके अलावा, एचपीवी आरएनए सीएसएच का उपयोग एचपीवी से संबंधित मल्टीफेनोटाइपिक साइनोसनल कार्सिनोमा के निदान के लिए किया जा सकता है जिसमें एचपीवी डीएनए सीएच16की तुलना में उच्च संकेत है। कई बहुचर विश्लेषण सुझाव है कि E6 और E7 प्रतिलिपि का पता लगाने oropharyngal एससीसी समग्र7,15,17,18 में एक बेहतर पूर्वानुमान के साथ सहसंबद्ध है और p16-सकारात्मक ओरोफैरिन्गियल एससीसी19,20का उपसमूह।
यहाँ हम मैनुअल HPV आरएनए CISH के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत FFPE स्लाइड पर एक किट निर्माता से प्राप्त के साथ प्रदर्शन किया.
Protocol
Representative Results
Discussion
एचपीवी आरएनए सीएसएच एक खरीदा किट के साथ प्रदर्शन वायरल प्रतिलिपि का पता लगाने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है और यह सक्रिय एचपीवी संक्रमण इंगित करता है। मैन्युअल रूप से प्रदर्शन किया, प्रोटोकॉल के चरणों …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों Hopital Europen जॉर्ज्स Pompidou और नेकर के पैथोलॉजी विभाग धन्यवाद (Laurianne Chambolle, Elodie मिशेल, और Gis$le Legall); PARCC के ऊतकविज्ञान मंच, होपिटल यूरोपेन जॉर्ज्स पॉम्पिडो (कोरिन लेसेफरे); भाषा संपादन के लिए वर्जीनिया क्लार्क; एलेक्जेंड्रा Elbakyan उसके योगदान के लिए.
Materials
| Hematoxylin solution, Gill No. 1 | Merck | GHS132 | |
| HybEZ Oven (110v) | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 321710 | |
| HybEZ slide rack | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 300104 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 310018 | |
| RNAscope 2.5 HD Detection Reagents-BROWN | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 322310 | This kit includes amplification reagents AMP1, AMP2, AMP3, AMP4, AMP5 and AMP6, and detection reagents DAB-A and DAB-B |
| RNAscope 3-Plex Negative Control Probe | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 320871 | DAPB |
| RNAscope 3-Plex Positive Control Probe | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 320861 | PPIB |
| RNAscope H202 & Protease Plus Reagent | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 322330 | Hydrogen Peroxyde x2 and Protease Plus x 1 |
| RNAscope Probe- HPV16/18 | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 311121 | |
| RNAscope Target Retrieval Reagents | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 322000 | |
| RNAscope Wash Buffer Reagents | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 310091 | Wash Buffer 50X x4 |
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