Chromogenic In Situ Hybridization è uno strumento per la diagnosi del cancro della testa e del collo correlate all'HPV
Summary
L’ibridazione dell’RNA cromogenica in situ del papillomavirus umano (HPV) è considerata uno degli standard d’oro per il rilevamento dell’infezione da papillomavirus umano attivo all’interno dei tumori. Permette la visualizzazione dell’espressione mRNA HPV E6-E7 con la localizzazione e la valutazione semiquantitativa del suo segnale.
Abstract
L’infezione da papillomavirus umano (HPV) è un importante fattore di rischio per un sottotipo di carcinoma a cellule squamose orofangeali (OPSCC), che tende ad essere associato a un risultato migliore rispetto all’OPSCC relativo all’alcol e al tabacco. L’ibridazione cromogenica in situ (CISH) dell’RNA virale dell’HPV potrebbe consentire la valutazione semiquantitativa delle trascrizioni virali delle proteine oncogeniche E6 ed E7 e una visualizzazione in situ con una buona risoluzione spaziale. Questa tecnica consente la diagnosi di un’infezione attiva con la visualizzazione della trascrizione HPV nelle cellule tumorali infettate da HPV. Un vantaggio di questa tecnica è l’evitare la contaminazione da cellule non neoplastiche infettate da HPV adiacenti al tumore. Nel complesso, le sue buone prestazioni diagnostiche sono considerate il gold standard per l’identificazione attiva dell’infezione da HPV. Poiché l’interazione delle proteine virali E6 ed E7 con le proteine cellulari pRb e p53 è obbligatoria per la trasformazione cellulare, HPV RNA CISH è funzionalmente rilevante e riflette acutamente l’infezione attiva oncogenica hPV. Questa tecnica è clinicamente rilevante anche dal momento che i livelli di trascrizione “bassa” o “alta” di HPV hanno aiutato l’identificazione di due gruppi di prognosi tra i pazienti affetti da cancro alla testa e al collo “bassi” o “alti”. Qui presentiamo il protocollo per i vetrini manuali HPV RNA CISH eseguiti su diapositive in paraffina (FFPE) fissate in formalina con un kit ottenuto dal produttore. Invece della rivelazione cromogenica, l’ibridazione dell’RNA in situ può essere eseguita anche con rivelazione fluorescente (RNA FISH). Può anche essere combinato con l’immunostaining convenzionale.
Introduction
HPV RNA CISH è un potente strumento per il rilevamento dell’infezione da HPV attivo, che può rivelarsi cruciale nelle lesioni benigne o maligne in varie posizioni come l’oropharynx o la cervice uterina. La rilevazione di un’infezione da HPV attiva può supportare la diagnosi di una lesione indotta da HPV e, di seguito, influenzarne il trattamento e la prognosi.
L’HPV è l’infezione trasmessa sessualmente più frequente e oltre 100 genotipi virali sono stati descritti1. Schematicamente, i genotipi a basso rischio come i genotipi 6 e 11 sono noti per indurre verruche genitali, papillomatosi respiratoria ricorrente e altre lesioni benigne, mentre i genotipi ad alto rischio come i genotipi 16 e 18 sono responsabili della maggior parte dei tumori cervicali e tumori anali e svolgono un ruolo nell’oncogenesi HNSCC in proporzioni variabili, come rappresentato dai dati epidemiologici regionali2.
Sono disponibili diversi strumenti per il rilevamento dell’infezione da HPV. Come un’infezione da HPV ad alto rischio porta all’espressione di proteine oncogeniche virali E6 ed E73, la rilevazione delle trascrizioni E6 ed E7 è ampiamente vista come il gold standard per l’identificazione dell’infezione da HPV attiva4. HPV RNA CISH può essere eseguito su campioni di FFPE che sono abbastanza facilmente ottenuti da pazienti affetti da varie malattie correlate all’HPV. Le sue prestazioni sono state valutate nella neoplasia intraelicale squamosa nella cervice, nell’ano e nella vagina, e nel carcinoma a cellule squamose invasive nella cervice, nell’ano e nel tratto aerodigestivo superiore5: raggiunge una sensibilità di oltre il 98% tra i casi positivi alla reazione a catena della polimerasi del DNA HPV (PCR). Questo è leggermente meglio di p16 immunostaining (93%) e l’ibridazione situ del DNA In situ (DNA ISH: 97%), che sono più comunemente utilizzati. In un’altra coorte di 57 pazienti con carcinoma a cellule squamose (SCC) derivante dalla regione della testa e del collo, dalla regione genitale, dalla pelle e dal tratto urinario, rispetto all’HPV DNA ISH, hPV RNA CISH ha ottenuto una migliore sensibilità (100% contro 88%) specificità (87% contro 74%)6.
L’immunostaining P16 è un marcatore indiretto che riflette l’interruzione del ciclo cellulare che può essere causata (ma non esclusivamente) dall’infezione da HPV4,7. Questo test economico possiede una buona sensibilità e un valore predittivo negativo ed è raccomandato come marcatore surrogato di infezione da HPV ad alto rischio nel cancro dell’orofarye (OPC) dal College of American Pathologists (CAP) e dall’Unione per l’Internazionale Controllo del cancro (UICC)8.
Anche se questo documento si concentra esclusivamente sulla rilevazione dell’HPV in HNSCC, HPV RNA CISH è clinicamente rilevante in varie altre condizioni che coinvolgono l’infezione da HPV. Per esempio, questa tecnica può migliorare l’accuratezza della diagnosi di lesioni intrapetali di basso grado della cervice (LSIL, precedentemente nota come neoplasia intraelilicale cervicale, grado 1 [CIN1]) per casi morfologicamente ambigui9. Per quanto riguarda l’Oropharyngeal SCC, HPV RNA CISH consente l’identificazione di SCC correlati all’HPV, etichettato come distinto dalla SCC orofaziale non correlata all’HPV nella recente ottava edizione della classificazione TNM del cancro alla testa e al collo (dell’Unione per il cancro internazionale Controllo [UICC])10. Dal momento che la SCC correlata all’HPV presenta una prognosi migliore con una maggiore sopravvivenza e una maggiore sensibilità alla radioterapia e alla chemioterapia rispetto all’HPV11,12,13, il rilevamento dell’infezione da HPV può avere un impatto gestione del paziente14,15. Inoltre, HPV RNA CISH può essere utilizzato per la diagnosi di carcinoma sinonasal multifenotico correlato all’HPV con un segnale superiore a HPV DNA CISH16. Diverse analisi multivariate suggeriscono che il rilevamento delle trascrizioni E6 ed E7 è correlato con una prognosi migliore in SCC oroferesia complessivamente7,15,17,18 e nel sottogruppo di p16-positivo orofaleale SCC19,20.
Qui presentiamo il protocollo per il manuale HPV RNA CISH eseguito su vetrini FFPE con un kit ottenuto dal produttore.
Protocol
Representative Results
Discussion
HPV RNA CISH eseguito con un kit acquistato è un potente strumento per il rilevamento di trascrizioni virali e indica l’infezione da HPV attivo. Eseguito manualmente, i passaggi del protocollo sono nel complesso facili da seguire e il kit acquistato è conveniente. Questa tecnica permette la colorazione di 19 campioni istologici più una diapositiva di controllo in una sola volta, e il saggio dura circa 8 h. È fondamentale non lasciare che i campioni si asciughino tra i passaggi, salvo diversamente specificato. La cond…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano il dipartimento di Patologia di Hopital Européen Georges Pompidou e Necker (Laurianne Chambolle, Elodie Michel, e Gisèle Legall); la piattaforma di istologia di PARCC, Hopital Européen Georges Pompidou (Corinne Lesaffre); Virginia Clark per l’editing di lingue; Alexandra Elbakyan per il suo contributo.
Materials
| Hematoxylin solution, Gill No. 1 | Merck | GHS132 | |
| HybEZ Oven (110v) | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 321710 | |
| HybEZ slide rack | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 300104 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 310018 | |
| RNAscope 2.5 HD Detection Reagents-BROWN | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 322310 | This kit includes amplification reagents AMP1, AMP2, AMP3, AMP4, AMP5 and AMP6, and detection reagents DAB-A and DAB-B |
| RNAscope 3-Plex Negative Control Probe | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 320871 | DAPB |
| RNAscope 3-Plex Positive Control Probe | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 320861 | PPIB |
| RNAscope H202 & Protease Plus Reagent | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 322330 | Hydrogen Peroxyde x2 and Protease Plus x 1 |
| RNAscope Probe- HPV16/18 | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 311121 | |
| RNAscope Target Retrieval Reagents | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 322000 | |
| RNAscope Wash Buffer Reagents | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 310091 | Wash Buffer 50X x4 |
Referências
- Lowy, D. R., Schiller, J. T. Reducing HPV-associated cancer globally. Cancer Prevention Research.(Philadelphia, PA). 5 (1), 18-23 (2012).
- Laban, S., Hoffmann, T. K. Human Papillomavirus Immunity in Oropharyngeal Cancer: Time to Change the Game?. Clinical Cancer Research. 24 (3), 505-507 (2018).
- Wiest, T., Schwarz, E., Enders, C., Flechtenmacher, C., Bosch, F. X. Involvement of intact HPV16 E6/E7 gene expression in head and neck cancers with unaltered p53 status and perturbed pRb cell cycle control. Oncogene. 21 (10), 1510-1517 (2002).
- Ndiaye, C., et al. HPV DNA, E6/E7 mRNA, and p16INK4a detection in head and neck cancers: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Oncology. 15 (12), 1319-1331 (2014).
- Mills, A. M., Dirks, D. C., Poulter, M. D., Mills, S. E., Stoler, M. H. HR-HPV E6/E7 mRNA In Situ Hybridization. The American Journal of Surgical Pathology. 41 (5), 607-615 (2017).
- Mendez-Pena, J. E., Sadow, P. M., Nose, V., Hoang, M. P. RNA chromogenic in situ hybridization assay with clinical automated platform is a sensitive method in detecting high-risk human papillomavirus in squamous cell carcinoma. Human Pathology. 63, 184-189 (2017).
- Mirghani, H., et al. Diagnosis of HPV driven oropharyngeal cancers: Comparing p16 based algorithms with the RNAscope HPV-test. Oral Oncology. 62, 101-108 (2016).
- Lewis, J. S., et al. Human Papillomavirus Testing in Head and Neck Carcinomas: Guideline From the College of American Pathologists. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 142 (5), 559-597 (2018).
- Mills, A. M., Coppock, J. D., Willis, B. C., Stoler, M. H. HPV E6/E7 mRNA In Situ Hybridization in the Diagnosis of Cervical Low-grade Squamous Intraepithelial Lesions (LSIL). The American Journal of Surgical Pathology. 42 (2), 192-200 (2018).
- El-Naggar, A., Chan, J. K. C., Grandis, J. R., Takata, T., Slootweg, P. J. . WHO Classification of Head and Neck Tumours. , (2017).
- Ang, K. K., et al. Human papillomavirus and survival of patients with oropharyngeal cancer. The New England Journal of Medicine. 363 (1), 24-35 (2010).
- Badoual, C., et al. PD-1-expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer. Pesquisa do Câncer. 73 (1), 128-138 (2013).
- Outh-Gauer, S., et al. Immunotherapy in head and neck cancers: a new challenge for immunologists, pathologists and clinicians. Cancer Treatment Reviews. 65, 54-64 (2018).
- Mirghani, H., et al. Diagnosis of HPV-driven head and neck cancer with a single test in routine clinical practice. Modern Pathology. 28 (12), 1518-1527 (2015).
- Bishop, J. A., et al. Detection of Transcriptionally Active High-risk HPV in Patients With Head and Neck Squamous Cell Carcinoma as Visualized by a Novel E6/E7 mRNA In Situ Hybridization Method. The American Journal of Surgical Pathology. 36 (12), 1874-1882 (2012).
- Hsieh, M. -. S., Lee, Y. -. H., Jin, Y. -. T., Huang, W. -. C. Strong SOX10 expression in human papillomavirus-related multiphenotypic sinonasal carcinoma: report of 6 new cases validated by high-risk human papillomavirus mRNA in situ hybridization test. Human Pathology. 82, 264-272 (2018).
- Shi, W., et al. Comparative Prognostic Value of HPV16 E6 mRNA Compared With In Situ Hybridization for Human Oropharyngeal Squamous Carcinoma. Journal of Clinical Oncology. 27 (36), 6213-6221 (2009).
- Kuo, K. -. T., et al. The biomarkers of human papillomavirus infection in tonsillar squamous cell carcinoma—molecular basis and predicting favorable outcome. Modern Pathology. 21 (4), 376-386 (2008).
- Augustin, J., et al. Evaluation of the efficacy of the four tests (p16 immunochemistry, PCR, DNA and RNA In situ Hybridization) to evaluate a Human Papillomavirus infection in head and neck cancers: a cohort of 348 French squamous cell carcinomas. Human Pathology. , (2018).
- Jung, A. C., et al. Biological and clinical relevance of transcriptionally active human papillomavirus (HPV) infection in oropharynx squamous cell carcinoma. International Journal of Cancer. 126 (8), 1882-1894 (2009).
- Augustin, J., et al. HPV RNA CISH score identifies two prognostic groups in a p16 positive oropharyngeal squamous cell carcinoma population. Modern Pathology. , (2018).
- Evans, M. F., et al. HPV E6/E7 RNA In Situ Hybridization Signal Patterns as Biomarkers of Three-Tier Cervical Intraepithelial Neoplasia Grade. PLOS ONE. 9 (3), e91142 (2014).
- Dreyer, J. H., Hauck, F., Oliveira-Silva, M., Barros, M. H. M., Niedobitek, G. Detection of HPV infection in head and neck squamous cell carcinoma: a practical proposal. Virchows Archiv. 462 (4), 381-389 (2013).
- Bingham, V., et al. RNAscope in situ hybridization confirms mRNA integrity in formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue samples. Oncotarget. , (2017).
