Kromogen in situ hybridisering SS et verktøy for HPV-relaterte hode og nakke kreftdiagnose
Summary
Human papillomavirus (HPV) RNA kromogen in situ hybridisering anses å være en av gull standardene for aktiv Human papillomavirus infeksjon deteksjon innen svulster. Det gjør at visualisering av HPV E6-E7 mRNA uttrykk med lokalisering og analyse evaluering av sitt signal.
Abstract
Human papillomavirus (HPV) infeksjon er en stor risikofaktor for en under type av orofaryngeal plateepitelkreft (OPSCC), som har en tendens til å være assosiert med et bedre utfall enn alkohol-og tobakk-relaterte OPSCC. Kromogen in situ hybridisering (CISH) av HPV viral RNA kunne tillate analyse evaluering av virale transkripsjoner av kreftfremkallende proteiner E6 og E7 og en in situ visualisering med en god romlig oppløsning. Denne teknikken tillater diagnostisering av en aktiv infeksjon med visualisering av HPV-transkripsjon i tumoral HPV-infiserte celler. En fordel med denne teknikken er å unngå forurensning fra nonneoplastic HPV-infiserte celler ved siden av svulsten. Samlet sett har god diagnose forestillinger det anses å være gullstandarden for aktiv HPV-infeksjon identifikasjon. Siden E6 og E7 viral protein interaksjon med celle proteiner pRb og p53 er obligatorisk for celle transformasjon, er HPV RNA CISH funksjonelt relevant og akutt reflekterer aktiv kreftfremkallende HPV-infeksjon. Denne teknikken er klinisk relevant i tillegg siden “lav” eller “høy” HPV transkripsjon nivåer bidratt til identifisering av to prognose grupper blant HPV-relaterte P16-positive hode og nakke kreftpasienter. Her presenterer vi protokollen for manuell HPV RNA CISH utført på formalin-faste parafin-embedded (FFPE) lysbilder med et kit Hentet fra produsenten. I stedet for kromogen åpenbaring kan RNA in situ-hybridisering også utføres med fluorescerende åpenbaringer (RNA FISH). Det kan også kombineres med konvensjonelle immunostaining.
Introduction
HPV RNA CISH er et kraftig verktøy for påvisning av aktiv HPV-infeksjon, som kan vise seg å være avgjørende i godartet eller ondartede lesjoner på ulike steder som oropharynx eller livmor cervix. Påvisning av en aktiv HPV-infeksjon kan støtte diagnostisering av en HPV-indusert lesjon, og dermed påvirke sin behandling og prognose.
HPV er den hyppigste seksuelt overførbare infeksjonen, og over 100 viral genotyper har blitt beskrevet1. Skjematisk, lav-risk genotyper som genotyper 6 og 11 er kjent for å indusere genital warts, tilbakevendende respiratory papillomatosis, og andre godartet lesjoner, mens høy risiko genotyper som genotyper 16 og også 18 er ansvarlig for de fleste livmorhalskreft og anal kreft og spille en rolle i HNSCC oncogenesis i variable proporsjoner som stod for av regionale epidemiologiske data2.
Flere verktøy er tilgjengelig for påvisning av HPV-infeksjon. Som en høy risiko HPV-infeksjon fører til uttrykk for viral kreftfremkallende proteiner E6 og E73, påvisning av E6 og E7 transkripsjoner er allment sett på som gullstandarden for aktiv HPV-infeksjon identifisering4. HPV RNA CISH kan utføres på FFPE prøver som er ganske lett innhentet fra pasienter som lider av ulike HPV-relaterte sykdommer. Ytelsen har blitt evaluert i plateepitel intraepithelial neoplasi i livmorhalsen, anus, og vagina, og i invasiv plateepitelkreft i livmorhalsen, anus, og den øvre aerodigestive skrift5: Det oppnår en følsomhet på over 98% blant HPV DNA polymerase kjedere reaksjon (PCR)-positive tilfeller. Dette er litt bedre enn P16 immunostaining (93%) og HPV DNA in situ hybridisering (DNA ISH: 97%), som er mer vanlig brukt. I en annen kohort av 57 pasienter med plateepitelkreft (SCC) som oppstår fra hodet og nakken regionen, genital regionen, huden, og urinveiene, sammenlignet med HPV DNA ISH, HPV RNA CISH oppnådde bedre følsomhet (100% versus 88%) og spesifisitet (87% versus 74%)6.
P16 immunostaining er en indirekte markør som reflekterer celle syklus forstyrrelser som kan være forårsaket (men ikke utelukkende) av HPV-infeksjon4,7. Denne kostnadseffektive testen har god følsomhet og en negativ prediktiv verdi og anbefales som et surrogat merke med høy risiko for HPV-infeksjon i oropharynx kreft (OPC) ved College of American patologer (CAP) og av Union for International Kreft Control (UICC)8.
Selv om dette papiret utelukkende fokuserer på påvisning av HPV i HNSCC, er HPV RNA CISH klinisk relevant i ulike andre forhold som involverer HPV-infeksjon. For eksempel kan denne teknikken forbedre nøyaktigheten av diagnosen lav kvalitet plateepitel intraepithelial lesjoner i livmorhalsen (LSIL, tidligere kjent som cervical intraepithelial neoplasi, Grade 1 [CIN1]) for morfologisk tvetydige tilfeller9. Når det gjelder orofaryngeal SCC, HPV RNA CISH tillater identifisering av HPV-relaterte SCC, merket som skiller fra HPV-urelaterte orofaryngeal SCC i den siste åttende utgaven av TNM klassifisering av hode og nakke Cancer (av Union for International Cancer Kontroll [UICC])10. Siden HPV-relaterte SCC utstillinger en bedre prognose med lengre overlevelse og forbedret strålebehandling og kjemoterapi følsomhet enn HPV-urelaterte SCC11,12,13, påvisning av HPV-infeksjon kan påvirke pasientbehandling14,15. Dessuten kan HPV RNA CISH brukes for diagnostisering av HPV-relaterte multiphenotypic sinonasal kreft med et høyere signal enn HPV DNA CISH16. Flere multivariabel analyser tyder på at påvisning av E6 og E7 transkripsjoner er korrelert med en bedre prognose i orofaryngeal SCC totalt7,15,17,18 og i undergruppe av P16-positive orofaryngeal SCC19,20.
Her presenterer vi protokollen for manuell HPV RNA CISH utført på FFPE lysbilder med et kit Hentet fra produsenten.
Protocol
Representative Results
Discussion
HPV RNA CISH utført med en kjøpt Kit er et kraftig verktøy for påvisning av viral transkripsjoner og det indikerer aktiv HPV-infeksjon. Utføres manuelt, trinnene i protokollen er generelle enkle å følge, og den kjøpte Kit er praktisk. Denne teknikken gjør at farging av 19 histologiske prøver pluss en kontroll lysbilde på en gang, og analysen varer rundt 8 h. Det er viktig å ikke la prøvene tørke ut mellom trinn med mindre annet er nevnt. Forbehandling tilstand må kanskje justeres avhengig av manipulert vev…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker avdelingen for patologi av Hopital Européen Georges Pompidou og Necker (Laurianne Chambolle, Elodie Michel, og Gisèle Legall); den histologi plattform av PARCC, Hopital Européen Georges Pompidou (Corinne Lesaffre); Virginia Clark for språk redigering; Alexandra Elbakyan for hennes bidrag.
Materials
| Hematoxylin solution, Gill No. 1 | Merck | GHS132 | |
| HybEZ Oven (110v) | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 321710 | |
| HybEZ slide rack | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 300104 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 310018 | |
| RNAscope 2.5 HD Detection Reagents-BROWN | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 322310 | This kit includes amplification reagents AMP1, AMP2, AMP3, AMP4, AMP5 and AMP6, and detection reagents DAB-A and DAB-B |
| RNAscope 3-Plex Negative Control Probe | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 320871 | DAPB |
| RNAscope 3-Plex Positive Control Probe | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 320861 | PPIB |
| RNAscope H202 & Protease Plus Reagent | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 322330 | Hydrogen Peroxyde x2 and Protease Plus x 1 |
| RNAscope Probe- HPV16/18 | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 311121 | |
| RNAscope Target Retrieval Reagents | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 322000 | |
| RNAscope Wash Buffer Reagents | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 310091 | Wash Buffer 50X x4 |
Referências
- Lowy, D. R., Schiller, J. T. Reducing HPV-associated cancer globally. Cancer Prevention Research.(Philadelphia, PA). 5 (1), 18-23 (2012).
- Laban, S., Hoffmann, T. K. Human Papillomavirus Immunity in Oropharyngeal Cancer: Time to Change the Game?. Clinical Cancer Research. 24 (3), 505-507 (2018).
- Wiest, T., Schwarz, E., Enders, C., Flechtenmacher, C., Bosch, F. X. Involvement of intact HPV16 E6/E7 gene expression in head and neck cancers with unaltered p53 status and perturbed pRb cell cycle control. Oncogene. 21 (10), 1510-1517 (2002).
- Ndiaye, C., et al. HPV DNA, E6/E7 mRNA, and p16INK4a detection in head and neck cancers: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Oncology. 15 (12), 1319-1331 (2014).
- Mills, A. M., Dirks, D. C., Poulter, M. D., Mills, S. E., Stoler, M. H. HR-HPV E6/E7 mRNA In Situ Hybridization. The American Journal of Surgical Pathology. 41 (5), 607-615 (2017).
- Mendez-Pena, J. E., Sadow, P. M., Nose, V., Hoang, M. P. RNA chromogenic in situ hybridization assay with clinical automated platform is a sensitive method in detecting high-risk human papillomavirus in squamous cell carcinoma. Human Pathology. 63, 184-189 (2017).
- Mirghani, H., et al. Diagnosis of HPV driven oropharyngeal cancers: Comparing p16 based algorithms with the RNAscope HPV-test. Oral Oncology. 62, 101-108 (2016).
- Lewis, J. S., et al. Human Papillomavirus Testing in Head and Neck Carcinomas: Guideline From the College of American Pathologists. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 142 (5), 559-597 (2018).
- Mills, A. M., Coppock, J. D., Willis, B. C., Stoler, M. H. HPV E6/E7 mRNA In Situ Hybridization in the Diagnosis of Cervical Low-grade Squamous Intraepithelial Lesions (LSIL). The American Journal of Surgical Pathology. 42 (2), 192-200 (2018).
- El-Naggar, A., Chan, J. K. C., Grandis, J. R., Takata, T., Slootweg, P. J. . WHO Classification of Head and Neck Tumours. , (2017).
- Ang, K. K., et al. Human papillomavirus and survival of patients with oropharyngeal cancer. The New England Journal of Medicine. 363 (1), 24-35 (2010).
- Badoual, C., et al. PD-1-expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer. Pesquisa do Câncer. 73 (1), 128-138 (2013).
- Outh-Gauer, S., et al. Immunotherapy in head and neck cancers: a new challenge for immunologists, pathologists and clinicians. Cancer Treatment Reviews. 65, 54-64 (2018).
- Mirghani, H., et al. Diagnosis of HPV-driven head and neck cancer with a single test in routine clinical practice. Modern Pathology. 28 (12), 1518-1527 (2015).
- Bishop, J. A., et al. Detection of Transcriptionally Active High-risk HPV in Patients With Head and Neck Squamous Cell Carcinoma as Visualized by a Novel E6/E7 mRNA In Situ Hybridization Method. The American Journal of Surgical Pathology. 36 (12), 1874-1882 (2012).
- Hsieh, M. -. S., Lee, Y. -. H., Jin, Y. -. T., Huang, W. -. C. Strong SOX10 expression in human papillomavirus-related multiphenotypic sinonasal carcinoma: report of 6 new cases validated by high-risk human papillomavirus mRNA in situ hybridization test. Human Pathology. 82, 264-272 (2018).
- Shi, W., et al. Comparative Prognostic Value of HPV16 E6 mRNA Compared With In Situ Hybridization for Human Oropharyngeal Squamous Carcinoma. Journal of Clinical Oncology. 27 (36), 6213-6221 (2009).
- Kuo, K. -. T., et al. The biomarkers of human papillomavirus infection in tonsillar squamous cell carcinoma—molecular basis and predicting favorable outcome. Modern Pathology. 21 (4), 376-386 (2008).
- Augustin, J., et al. Evaluation of the efficacy of the four tests (p16 immunochemistry, PCR, DNA and RNA In situ Hybridization) to evaluate a Human Papillomavirus infection in head and neck cancers: a cohort of 348 French squamous cell carcinomas. Human Pathology. , (2018).
- Jung, A. C., et al. Biological and clinical relevance of transcriptionally active human papillomavirus (HPV) infection in oropharynx squamous cell carcinoma. International Journal of Cancer. 126 (8), 1882-1894 (2009).
- Augustin, J., et al. HPV RNA CISH score identifies two prognostic groups in a p16 positive oropharyngeal squamous cell carcinoma population. Modern Pathology. , (2018).
- Evans, M. F., et al. HPV E6/E7 RNA In Situ Hybridization Signal Patterns as Biomarkers of Three-Tier Cervical Intraepithelial Neoplasia Grade. PLOS ONE. 9 (3), e91142 (2014).
- Dreyer, J. H., Hauck, F., Oliveira-Silva, M., Barros, M. H. M., Niedobitek, G. Detection of HPV infection in head and neck squamous cell carcinoma: a practical proposal. Virchows Archiv. 462 (4), 381-389 (2013).
- Bingham, V., et al. RNAscope in situ hybridization confirms mRNA integrity in formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue samples. Oncotarget. , (2017).
