Lipidomics e Transcriptomics em Doenças Neurológicas
Summary
Este artigo apresenta um protocolo modular para lipidômica tecidual e transcriptômica, e lipidomias plasmáticas em modelos de camundongos de doenças neurológicas que visam lipídios subjacentes à inflamação e atividade neuronal, lipídios de membrana, mensageiros a jusante e enzimas/receptores de codificação de mRNA. São delineados procedimentos de amostragem, processamento de amostras, extração e quantificação.
Abstract
Os lipídios servem como a interface primária para insultos cerebrais ou estímulos propícios a doenças neurológicas e são um reservatório para a síntese de lipídios com várias sinalizações ou função de ligantes que podem ressaltar o aparecimento e progressão de doenças. Muitas vezes mudando no nível pré-attomático, lipídios são uma fonte emergente de alvos de drogas e biomarcadores. Muitas doenças neurológicas exibem neuroinflamação, neurodegeneração e excitabilidade neuronal como marcas comuns, parcialmente moduladas por sistemas específicos de sinalização lipídica. A interdependência e inter-relação da síntese de vários lipídios leva a uma análise multilímida, multinzimida e multirreceptora, a fim de derivar as semelhanças e especificidades dos contextos neurológicos e acelerar o desenrolar de aspectos mecanicistas do início e da progressão da doença. Atribuir papéis lipídes a regiões cerebrais distintas avança na determinação do fenótipo molecular lipídeto e da morfologia associados a uma doença neurológica.
Apresentado aqui é um protocolo modular adequado para a análise de lipídios de membrana e sinais lipídes a jusante, juntamente com mRNA de enzimas e mediadores subjacentes à sua funcionalidade, extraídos de regiões cerebrais discretas que são relevantes para uma determinada doença neurológica e/ou condição. Para garantir um perfil lipidômico comparativo preciso, os fluxos de trabalho e os critérios operacionais foram otimizados e padronizados para: i) amostragem cerebral e dissecção de regiões de interesse, ii) co-extração de múltiplos sinais lipídicos e lipídios de membrana, iii) extração lipídica/mRNA dupla, iv) quantificação por monitoramento de reação múltipla de cromatografia líquida (LC/MRM) e v) perfil de mRNA padrão. Este fluxo de trabalho é favorável às baixas quantidades teciduais obtidas pela amostragem das sub-regiões cerebrais funcionalmente discretas (ou seja, por perfuração cerebral), impedindo assim o viés na análise multimolecular devido à heterogeneidade tecidual e/ou variabilidade animal. Revelar consequências periféricas de doenças neurológicas e estabelecer leituras moleculares translacionais de estados de doenças neurológicas, amostragem de órgãos periféricos, processamento e sua análise lipidómica subsequente, bem como lipidómica plasmática, também são perseguidos e descritos. O protocolo é demonstrado em um modelo agudo de camundongos de epilepsia.
Introduction
Avanços recentes na função dos lipídios e seu papel no surgimento e progressão de doenças neurológicas abrem novos locais de pesquisa e desenvolvimento de novos alvos terapêuticos e elucidação de mecanismos de doença1. Diferenças documentadas na composição lipídica em diferentes regiões cerebrais, enfatizadas por técnicas modernas de imagem molecular, como imagem de espectrometria de massa e perfil avançado de espectrometria de massa, muda o paradigma da investigação lipídica de todo o cérebro para regiões cerebrais funcionalmente distintas e discretas. O fato de que a composição lipídica varia em diferentes regiões cerebrais leva a nova conceituação tanto da sensibilidade lipídica da membrana quanto da sinalização lipídica a jusante em resposta a um insulto cerebral ou estímulos através das regiões cerebrais funcionalmente distintas. Assim, os protocolos lipídes exigem novos desenvolvimentos para enfrentar o desafio de baixas quantidades teciduais para maior detecção e quantificação de resolução espacial, e, simultaneamente, análise de múltiplos componentes lipídides de membranas celulares e vias de sinalização. Além disso, a determinação de enzimas, ligantes lipídicos e receptores envolvidos na regulação de seus níveis e funções é primordial para elucidar as vias de sinalização afetadas em uma doença neurológica e orientar novas investigações mecanicistas em um contexto fisioterológico.
Além do aumento da resolução espacial cerebral, há duas grandes dificuldades que desafiam o desenvolvimento de novas abordagens neurolipdómicas. Primeiro, as moléculas de sinalização lipídica são tipicamente de baixa abundância em comparação com lipídios constitutivos de membrana. Em segundo lugar, o lipidome apresenta uma alta heterogeneidade estrutural, difícil de dissecar usando uma única abordagem analítica. Assim, os métodos de extração e analítica são adaptados a diferentes categorias lipídicas e comumente realizados em amostras de tecidos distintos2. Métodos lipídmicos de espingarda3 são excelentes ferramentas para revelar rapidamente um amplo perfil de lipídios de membrana, enquanto o aumento da sensibilidade e seletividade proporcionados pela descoberta e quantificação de massa spectrométricas são capitalizados para a investigação de lipídios de sinalização de baixa oferta, incluindo: i) lipídios inflamatórios e ii) lipídios envolvidos na modulação da atividade neuronal, como endocanabinóides (eCBs), lipídios ligados a amino- etc.4,5. Para abranger alterações lipídicas tanto na membrana celular quanto no nível de sinalização ocorrendo em regiões cerebrais de modelos de doenças neurológicas, tipicamente a extração e análise lipídica são realizadas em amostras de tecidos distintos, obtidas de diferentes lotes animais ou de diferentes hemisférios, ou dissecando uma região de tecido maior em múltiplos pedaços. Quando os níveis de mRNA de receptores enzimáticos também são de interesse, sua investigação normalmente requer a aquisição de uma amostra de tecido distinta. Por exemplo, a investigação de lipídios de membrana, canabinoides endógenos e mRNA exigiria três amostras diferentes de tecido, (por exemplo, duas amostras para os dois métodos de extração lipídica-lipídios-lipídios e lipídios de sinalização – e subsequentes dois métodos de análise lipídica – e uma amostra para análise mRNA). A investigação de lipídios inflamatórios e canabinoides endógenos requerem duas amostras de tecido distintas, métodos de extração e métodos de análise, respectivamente. Outro exemplo é a investigação de mRNA e de qualquer categoria lipídica em uma amostra de perfuração cerebral ou microdissecção a laser que, consequentemente, requer dois animais distintos para obter duas amostras por cérebro (sub)região. Uma extensão substancial de variabilidade e/ou baixa reprodutibilidade dos resultados ocorre frequentemente nesses casos, originária de variabilidade biológica e/ou heterogeneidade tecidual. Guiado por essas limitações práticas da análise multimolecular, ocorrendo particularmente em alta resolução espacial no cérebro, foi projetado um protocolo de neurolipidomia de três módulos englobando: 1) coextração e co-análise por LC/MRM de lipídios inflamatórios (por exemplo, eicosanoides (EI)) e lipídios envolvidos na modulação da atividade neuronal, como eCBs2; 2) co-extração de fosfolipídios (PLs) e eCBs com análise subsequente de LC/MRM multiscan e análise de varredura de perdas precursoras/neutras2; e 3) extração dupla de membrana (fosfo)lipídios e eCBs, bem como mRNA, com análise subsequente de sequenciamento de LC/MRM e qPCR ou RNA6. Dependendo da questão biológica a ser abordada em uma doença neurológica e na região de interesse cerebral, uma combinação do primeiro e do segundo protocolo, ou o primeiro e o terceiro protocolo, podem ser aplicados na mesma amostra de tecido para tecidos que pesam cerca de 4 mg. O primeiro e o terceiro protocolos podem ser aplicados independentemente para tecidos em torno de 2 mgs. O segundo protocolo pode ser aplicado para tecidos pesando apenas 0,5 mgs. Independentemente do módulo de protocolo neurolipdidomático selecionado, a amostragem de tecidos e processamento pré-analítico, o isolamento cerebral e a dissecção da região, bem como o procedimento para o sacrifício do modelo animal são padronizados e idênticos para os três módulos do protocolo. Em nossa investigação de doenças neurológicas, órgãos periféricos relevantes para as consequências patológicas da doença também são sempre coletados e analisados por meio desses protocolos modulares. Além disso, o sangue é regularmente amostrado para lipidomia plasmática para servir como uma ferramenta de leitura de doenças neurológicas com uma visão sobre aplicações translacionais prospectivas. O protocolo de lipidomia modular aqui apresentado é muito versátil: escalável a maiores quantidades de tecido e facilmente aplicável para praticamente qualquer tipo de tecido e doença. Para a aplicação do protocolo modular (Figura 1), em doenças neurológicas, qualquer modelo padronizado de início e progressão de distúrbios neurológicos, como lesão cerebral traumática, doença de Parkinson, doença de Alzheimer ou epilepsia são amenáveis.
Esses protocolos têm sido extensivamente aplicados para estudar alterações no lipidome tecidual e/ou transcriptome na fase aguda da epilepsia no modelo de camundongo induzido por ácido kainico (KA) de epilepsia2,7, um modelo amplamente utilizado em estudos pré-clínicos devido à semelhança com a epilepsia do lobo temporal humano (TLE)8,9,10,11. Utilizando esses protocolos, o potencial terapêutico de drogas como Palmitoylethanolamide (PEA)12,13 foi avaliado no mesmo modelo de camundongos de epilepsia. O estudo identificou alterações lipídicas e mRNA em alta e baixa resolução espacial no cérebro e na periferia, no ponto de tempo de intensidades máximas agudas de convulsão aguda (em 60 min de indução pós-doutorado), e sobre o tratamento subcrônico e agudo com PEA em quatro pontos de tempo diferentes (20, 60, 120 e 180 min) pós-indução de convulsão ka, uma janela de tempo cobrindo a fase aguda de epilepsia. Foram coletados em cada momento os camundongos injetados por KA, camundongos tratados com PEA, agudos e subchamados, bem como camundongos de controle de veículos e veículos pea, coletados em cada ponto12,13, e investigados com essa análise molecular. Os dados moleculares foram correlacionados com fenótipos comportamentais obtidos pela pontuação de convulsões, bem como com dados derivados da imunohistoquímica em processos neurodegenerative, a fim de desvendar a progressão da fase aguda de epilepsia e o potencial do PEA para aliviá-lo.
Protocol
Representative Results
Discussion
A metodologia neurolipidômica e transcriômica descrita aqui é uma média viável para investigar qualquer doença ou desenvolvimento saudável em alta e baixa resolução espacial no cérebro e órgãos periféricos. Devido aos procedimentos otimizados de amostragem e manuseio de plasma, a análise lipidômica plasmática também pode ser realizada a partir dos mesmos animais sacrificados por lipidemia tecidual e transcrição, melhorando assim a confiabilidade dos correlatos moleculares do sangue tecidual e da descob…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dedicamos este artigo à Dra. Durante a finalização deste manuscrito, a Dra. Ela é a personificação da paixão pela ciência e do engajamento altruísta no trabalho em equipe para cumprir um propósito significativo de pesquisa. Ela sempre sonhou em contribuir significativamente para o maior bem-estar dos humanos. Sua natureza de bom coração nunca foi comprometida pelas estradas extenuantes da ciência e da vida. Ela permanecerá inestimável, e para sempre, em nossos corações.
Julia M. Post foi financiada pelo Focus Program for Translational Neuroscience (FTN) no University Medical Center da Johannes Gutenberg University Mainz e atualmente é financiada pelo projeto SPP-2225 EXIT para LB. Raissa Lerner foi parcialmente financiada pelo projeto DZHK 81X2600250 para LB e Lipidomics Core Facility. O financiamento parcial para esses estudos foi fornecido pelo Lipidomics Core Facility, Institute of Physiological Chemistry, e intramural funds (to LB) do Centro Médico Universitário da Universidade Johannes Gutenberg Mainz.
Materials
| 12(S)-HETE | Biomol | Cay10007248-25 | Lipid Std |
| 12(S)-HETE-d8 | Biomol | Cay334570-25 | Lipid Std |
| 1200 series LC System | Agilent | Instrumentation/LCMS | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | Instrumentation/qPCR | |
| 5(S)-HETE-d8 | Biomol | Cay 334230 | Lipid Std |
| ABI 7300 Real-Time PCR cycler | Applied Biosystems | Instrumentation/qPCR | |
| Acetonitrile LC-MS Chroma Solv | Honeywell | 9814920 | Solvent/LCMS |
| amber eppendorf tubes | Eppendorf | Sample Prep. | |
| Analyst 1.6.2 Software | AB SCIEX, Darmstadt | Software | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | Instrumentation/Sample prep. | |
| Arachidonic Acid-d8 MS Standard | Biomol | Cay-10007277 | Lipid Std |
| Bessmann Tissue Pulverizer | Spectrum Laboratories, Inc. (Breda, Netherlands) | Instrumentation/Sample prep. | |
| Bino | Zeiss | Microscopy | |
| cleaved Caspase 3 antibody | Cellsignaling | 9661S | Microscopy |
| Cryostat, Leica CM3050 S | Leica Biosystems | Instrumentation/Sample prep. | |
| CTC HTC PAL autosampler | CTC Analytics AG | Instrumentation/LCMS | |
| Dumont Curved Forceps Dumoxel #7 | FST | 11271-30 | Surgical Tools |
| Dumont Forceps Super fine tip #5SF (x2) | FST | 11252-00 | Surgical Tools |
| EDTA 1000 A Röhrchen | Kabe Labortechnik | 078001 | Sample Prep. |
| EP-1 EconoPump | BioRAD | 700BR07757 | Instrumentation/Sample prep. |
| Fine Forceps Mirror Finish | FST | 11412-11 | Surgical Tools |
| Fine Iris Scissors straight sharp | FST | 14094-11 | Surgical Tools |
| Fine Scissor Tungsten Carbide straight | FST | 14568-09 | Surgical Tools |
| Iris Spatulae | FST | 10094-13 | Surgical Tools |
| Kainic acid | Abcam | ab120100 | Epileptic drug |
| Lipid View software | AB SCIEX, Darmstadt | Software | |
| LPC 17:0 | Avanis Polaris | 855676P | Lipid Std |
| LPC 18:0 | Avanis Polaris | 855775P | Lipid Std |
| Luna 2,5µm C18(2)- HAST 100A LC column | Phenomenex | 00D-4446-B0 | Instrumentation/LCMS |
| Magnifying lamp | Maul GmbH | Instrumentation/Sample prep. | |
| Methanol LC-MS Chroma Solv 99.9% | Honeywell | 9814920 | Solvent/LCMS |
| Motic Camara | Motic | Microscopy | |
| MTBE | Honeywell | 34875-1L | Solvent/LCMS |
| MultiQuant 3.0 quantitation software package | AB SCIEX, Darmstadt | Software | |
| NanoDrop 2000c Spectrophotometer | Thermo Scientific | Instrumentation/qPCR | |
| PA 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 840857P | Lipid Std |
| PA 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1404 | Lipid Std |
| Palmitoyl Ethanolamide | Biomol | Cay90350-100 | Lipid Std |
| Palmitoyl Ethanolamide-d5 | Biomol | Cay9000573-5 | Lipid Std |
| PC 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 850457P | Lipid Std |
| PC 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 850457P | Lipid Std |
| PC 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1004 | Lipid Std |
| PE 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 850757P | Lipid Std |
| PE 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1104 | Lipid Std |
| PG 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 840457P | Lipid Std |
| PG 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1204 | Lipid Std |
| PI 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1504 | Lipid Std |
| Precelleys 24 | Peqlab | Instrumentation/Sample prep. | |
| Precellys Keramik-Kügelchen | Peqlab | 91-pcs-ck14p | Sample Prep. |
| Precellys Stahlkugeln 2,8mm | Peqlab | 91-PCS-MK28P | Sample Prep. |
| Precellys-keramik-kit 1,4 mm | VWR | 91-PCS-CK14 | Sample Prep. |
| Prostaglandin D2 | Biomol | Cay 12010 | Lipid Std |
| Prostaglandin D2-d4 | Biomol | Cay 312010 | Lipid Std |
| Prostaglandin E2 | Biomol | Cay10007211-1 | Lipid Std |
| Prostaglandin E2-d9 | Biomol | Cay10581-50 | Lipid Std |
| PS 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1304 | Lipid Std |
| Q Trap 5500 triple-quadrupole linear ion trap MS | AB SCIEX | AU111609004 | Instrumentation/LCMS |
| Real Time PCR System | Appliert Biosystem | Instrumentation/qPCR | |
| Resolvin D1 | Biomol | Cay10012554-11 | Lipid Std |
| Rneasy Mini Kit – RNAase-Free DNase Set (50) | Qiagen | 79254 | Sample Prep. |
| Security Guard precolumn | Phenomenex | Instrumentation/LCMS | |
| Shandon coverplates | Thermo Fisher | 72110017 | Microscopy |
| Shandon slide rack and lid | Thermo Fisher | 73310017 | Microscopy |
| SM 18:0 | Avanis Polaris | 860586P | Lipid Std |
| SM d18:1/12:0 | Avanis Polaris | LM-2312 | Lipid Std |
| Standard Forceps straight Smooth | FST | 11016-17 | Surgical Tools |
| Surgical Scissor ToughCut Standard Pattern | FST | 14130-17 | Surgical Tools |
| T3000 Thermocycler | Biometra | Instrumentation/qPCR | |
| Thromboxane B2 | Biomol | Cay19030-5 | Lipid Std |
| Thromboxane B2-d4 | Biomol | Cay319030-25 | Lipid Std |
| Tissue Lyser II | Qiagen/ Retsch | 12120240804 | Instrumentation/Sample prep. |
| Tissue Tek | Sakura Finetek | 4583 | Microscopy |
| Toluidinblau | Roth | 0300.2 | Microscopy |
| Vapotherm | Barkey | 4004734 | Instrumentation/Sample prep. |
| Wasser LC-MS Chroma Solv | VWR | 9814920 | Solvent/LCMS |
Referências
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