Оценка риска колоректального рака и распространенности по обнаружению целостности ДНК стула
Summary
Представленный диагностический комплект FL-DNA является экономичным и удобным для пользователя методом определения надежной вероятности наличия колоректального рака.
Abstract
В настоящее время ДНК стула может быть изолирована и проанализирована несколькими методами. Длинные фрагменты ДНК в стуле могут быть обнаружены с помощью анализа qPCR, который обеспечивает надежную вероятность наличия преднеопластических или неопластических колоректальных поражений. Этот метод, называемый флуоресценции долго ДНК (FL-ДНК), является быстрой, неинвазивной процедурой, которая является улучшением на первичной системы профилактики. Этот метод основан на оценке целостности фекальной ДНК путем количественного усиления конкретных целей геномной ДНК. В частности, оценка фрагментов ДНК длиной более 200 вт позволяет выявлять пациентов с колоректальными поражениями с очень высокой специфичностью. Тем не менее, эта система и все имеющиеся в настоящее время тесты ДНК стула представляют некоторые общие проблемы, которые необходимо решить (например, частота, с которой тесты должны быть проведены и оптимальное количество образцов стула, собранных в каждый момент для каждого человека). Тем не менее, основным преимуществом FL-ДНК является возможность использовать его в связи с тестом, который в настоящее время используется в программе скрининга CRC, известной как иммунохимический фекальный оккультный анализ крови (iFOBT). Действительно, оба теста могут быть выполнены на одной и той же выборке, что снижает затраты и достигает лучшего прогнозирования возможного присутствия колоректальных поражений.
Introduction
Колоректальный рак (CRC) происходит от многоступенчатого процесса, в котором здоровый эпителий медленно развивается в аденомы или полипы, которые прогрессируют в злокачественные канциномы с течениемвремени 1,2. Несмотря на высокий уровень заболеваемости КРП, за последнее десятилетие наблюдается тенденция к снижению долисмертей. Действительно, ранние диагностические инструменты, принятые в программах скрининга, привели к раннему выявлению и удалению преднеопластических аденомы или полипов4. Однако из-за различных технических ограничений ни один из этих методов не является оптимальным. Действительно, для того, чтобы улучшить чувствительность и специфичность, многие тесты ДНК стула были предложены в одиночку или в сочетании с текущей обычной диагностические тесты5,6.
Как правило, здоровая слизистая оболочка линяет в фекальный поток апоптотические колоноциты, в то время как больная слизистая оболочка отслаивается от неапоптотической колоноцитов. Фрагменты 200 bp или более в длину характеризуют неапоптотической ДНК. Эта ДНК называется длинной ДНК (L-ДНК) и стала утилизательным биомаркером для ранней диагностики CRC. L-ДНК может быть выделена из образца стула и количественно qPCR с помощью в пробирке диагностический FL-ДНК комплект7,,88,9,10,11,12.
Тест состоит из двух анализов для обнаружения фрагментов FL-ДНК в диапазоне от 138 bp до 339 bp. Каждый анализ позволяет усиление FL-ДНК (FAM), а также всплеск в ДНК (HEX). Для обеспечения оптимального усиления всех фрагментов тест был разделен на два анализа (названные “А” и “Б”). Ассай обнаруживает две области экзона 14 гена APC (NM_001127511) и фрагмент экзона 7 гена TP53 (NM_001276760). В ассе обнаруживается фрагмент экзона 14 гена APC (NM_001127511) и две области экзонов 5 и 8 гена TP53 (NM_001276760). Анализы не различают обнаруженные регионы. Пик ДНК соответствует ДНК лосося Oncorhynchus кета-лосик и позволяет проверить, что процедура была сделана должным образом и проверяет на возможное наличие ингибиторов, которые могут дать ложные отрицательные результаты. Концентрация FL-ДНК оценивается по абсолютной количественной оценке с использованием стандартного метода кривой и выражается как нг/реакция.
FL-DNA метод неинвазивный и недорогой тест ДНК стула, который, в сочетании с иммунохимическим на основе фекальных оккультных анализ крови (iFOBT), в настоящее время используется в программах скрининга CRC и позволяет лучше прогнозы CRC и / или высокого риска аденомы поражений12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Предыдущие исследования показали, что анализ целостности ДНК стула, извлеченный с помощью ручных и полуавтоматических подходов, может представлять собой альтернативный инструмент для раннего выявления колоректальных поражений7,,88,9,<…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы не имеют подтверждений.
Materials
| 1.5 mL and 2 mL polypropylene twist-lock tubes (DNase-, RNase-, DNA-, PCR inhibitor-free) | Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR | ||
| Absolute Ethanol (quality of analytical degree) | Reagent required for DNA extraction | ||
| Benchtop centrifuge | Maximum speed of 20000 x g. Instrument required for DNA extraction | ||
| EasyPGX analysis software version 2.0.0 | Diatech Pharmacogenetics | RT800-SW | Analysis software |
| EasyPGX centrifuge/vortex 8-well strips | Diatech Pharmacogenetics | RT803 | Instrument recommended for the Real Time PCR assay |
| EasyPGX qPCR instrument 96 | Diatech Pharmacogenetics | RT800-96 | Instrument recommended for the Real Time PCR assay |
| EasyPGX ready FL-DNA | Diatech Pharmacogenetics | RT029 | Kit required for the Real Time PCR assay |
| Micropipettes (volumes from 1 to 1.000 µL) | Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR | ||
| Powder-free disposable gloves | Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR | ||
| QIAamp Fast DNA Stool | Qiagen | 51604 | Kit recommended for the DNA extraction and purification from stool |
| Sterile filter tips DNase-, RNase-free (volumes from 1 to 1.000 µL) | Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR | ||
| Thermal block e.g. EasyPGX dry block | Diatech Pharmacogenetics | RT801 | Instrument required for DNA extraction |
| Vortex e.g. EasyPGX centrifuge/vortex 1.5 ml | Diatech Pharmacogenetics | RT802 | Instrument required for DNA extraction |
Referências
- Fearon, E. R. Molecular Genetics of Colorectal Cancer. Annual Review of Pathology. 6, 479-507 (2011).
- Sears, C. L., Garrett, W. S. Microbes, Microbiota, and Colon Cancer. Cell Host and Microbe. 15, 317-328 (2014).
- Levin, B., et al. Screening and Surveillance for the Early Detection of Colorectal Cancer and Adenomatous Polyps, 2008: A Joint Guideline From the American Cancer Society, the US Multi-Society Task Force on Colorectal Cancer, and the American College of Radiology. Gastroenterology. 134, 1570-1595 (2008).
- Bosch, L. J., et al. Molecular tests for colorectal cancer screening. Clinical Colorectal Cancer. 10, 8-23 (2011).
- Ahlquist, D. A. Molecular detection of colorectal neoplasia. Gastroenterology. 138, 2127-2139 (2010).
- Calistri, D., et al. Fecal multiple molecular tests to detect colorectal cancer in stool. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 1, 377-383 (2003).
- Calistri, D., et al. Detection of colorectal cancer by a quantitative fluorescence determination of DNA amplification in stool. Neoplasia. 6, 536-540 (2004).
- Calistri, D., et al. Quantitative fluorescence determination of long-fragment DNA in stool as a marker for the early detection of colorectal cancer. Cellular Oncology. 31, 11-17 (2009).
- Calistri, D., et al. Fecal DNA for noninvasive diagnosis of colorectal cancer in immunochemical fecal occult blood test-positive individuals. Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. 19, 2647-2654 (2010).
- De Maio, G., et al. Circulating and stool nucleic acid analysis for colorectal cancer diagnosis. World Journal of Gastroenterology. 20, 957-967 (2014).
- Rengucci, C., et al. Improved stool DNA integrity method for early colorectal cancer diagnosis. Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. 23, 2553-2560 (2014).
