تقييم مخاطر الإصابة بسرطان القولون والمستقيم وانتشاره عن طريق الكشف عن سلامة الحمض النووي البراز
Summary
مجموعة FL-DNA التشخيصية المقدمة هي طريقة موفرة للوقت وسهلة الاستخدام لتحديد الاحتمال الموثوق بوجود آفات سرطان القولون والمستقيم.
Abstract
في الوقت الحاضر، يمكن عزل الحمض النووي البراز وتحليلها بعدة طرق. يمكن الكشف عن الأجزاء الطويلة من الحمض النووي في البراز عن طريق فحص qPCR ، مما يوفر احتمالًا موثوقًا به لوجود آفات القولون والمستقيم قبل النيوبلاستيك أو النيوبلاستيك. هذه الطريقة، تسمى الحمض النووي الطويل فلورسينس (FL-DNA)، هي إجراء سريع وغير جراحي يعد تحسينًا على نظام الوقاية الأولي. وتستند هذه الطريقة إلى تقييم سلامة الحمض النووي البرازي عن طريق التضخيم الكمي لأهداف محددة من الحمض النووي الجينومي. على وجه الخصوص ، فإن تقييم شظايا الحمض النووي لفترة أطول من 200 bp يسمح بالكشف عن المرضى الذين يعانون من آفات القولون والمستقيم مع خصوصية عالية جدا. ومع ذلك، فإن هذا النظام وجميع اختبارات الحمض النووي البراز المتاحة حاليا ً تعرض بعض القضايا العامة التي تحتاج إلى معالجة (على سبيل المثال، وتيرة إجراء الاختبارات والعدد الأمثل من عينات البراز التي يتم جمعها في كل نقطة زمنية لكل فرد). ومع ذلك ، فإن الميزة الرئيسية لFL-DNA هي إمكانية استخدامه بالاقتران مع اختبار يستخدم حاليًا في برنامج فحص CRC ، المعروف باسم اختبار الدم الغامض البرازي القائم على البيوكيميائية المناعية (iFOBT). في الواقع ، يمكن إجراء كلا الاختبارين على نفس العينة ، مما يقلل من التكاليف ويحقق تنبؤًا أفضل بوجود آفات القولون والمستقيم في نهاية المطاف.
Introduction
سرطان القولون والمستقيم (لجنة حقوق الطفل) مستمد من عملية متعددة الخطوات التي يتطور الظهارة الصحية ببطء إلى أورام غدية أو الاورام الحميدة ، والتي تتطور إلى الأورام السرطانية الخبيثة مع مرور الوقت1،2. وعلى الرغم من ارتفاع معدل الإصابة في اتفاقية حقوق الطفل، لوحظ اتجاه تنازلي في النسبة المئوية للوفيات على مدى العقد الماضي3. في الواقع، أدت أدوات التشخيص المبكر المعتمدة في برامج الفحص إلى الكشف المبكر وإزالة الأورام الحميدة قبل النيوبلاستيك أو الاورام الحميدة4. ومع ذلك ، نظرا لاختلاف الحدود التقنية ، لا شيء من هذه الأساليب هو الأمثل. في الواقع، من أجل تحسين الحساسية والتحديد، وقد اقترح العديد من اختبارات الحمض النووي البراز وحدها أو في تركيبة مع الاختبارات التشخيصية الروتينية الحالية5,6.
عادة ، يلقي الغشاء المخاطي الصحي في الخلايا القولونية المبرئة في تيار البراز ، في حين أن الغشاء المخاطي المريض يقشر الخلايا القولونية غير المبرمجة. أجزاء من 200 نقطة بريتيش بتروليوم أو أكثر في الطول تميز الحمض النووي غير المبرمج. يسمى هذا الحمض النووي الحمض النووي الطويل (L-DNA) وأصبح علامة بيولوجية قابلة للاستخدام للتشخيص المبكر للجنة حقوق الطفل. يمكن عزل L-DNA من عينة البراز وكميا من قبل qPCR باستخدام في7المختبر التشخيص FL-DNA عدة7,8,,9,,10,,11,,12.
يتكون الاختبار من اثنين من المقالات للكشف عن شظايا FL-DNA تتراوح بين 138 نقطة أساس إلى 339 نقطة بالثانية. كل فحص يسمح تضخيم FL-DNA (FAM) وكذلك ارتفاع في الحمض النووي (HEX). لضمان التضخيم الأمثل لجميع الشظايا، تم تقسيم الاختبار إلى قسمين (اسمه “A” و “B”). يكتشف الناياج A منطقتين من exon 14 من جين APC (NM_001127511) وجزء من exon 7 من جين TP53 (NM_001276760). يكتشف المنازى B جزءًا من exon 14 من جين APC (NM_001127511) ومنطقتين من الطاردات 5 و 8 من جين TP53 (NM_001276760). لا تميز المقالات بين المناطق المكتشفة. يتوافق الحمض النووي للارتفاع في الحمض النووي لحمض هونورينتشوس كيتا السلمون الحمض النووي ويمكّن من التحقق من أن الإجراء قد تم بشكل صحيح ويتحقق من الوجود المحتمل للمثبطات ، والتي قد تسفر عن نتائج سلبية كاذبة. يتم تقييم تركيز FL-DNA عن طريق التحديد الكمي المطلق باستخدام طريقة المنحنى القياسي ويتم التعبير عنه على أنه نانوغرام /رد فعل.
طريقة FL-DNA هي اختبار الحمض النووي البراز غير الغازية وغير مكلفة التي، جنبا إلى جنب مع اختبار الدم الخفي البرازي القائم على المناعة الكيميائية (iFOBT)، ويستخدم حاليا في برامج فحص لجنة حقوق الطفل ويسمح لتنبؤات أفضل من CRC و / أو آفات الورم الحميد عالية الخطورة12.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد أظهرت الدراسات السابقة أن تحليل سلامة الحمض النووي من البراز المستخرجة من النهج اليدوية وشبه التلقائية يمكن أن تمثل أداة بديلة للكشف المبكر عن آفات القولون والمستقيم7،8،9,،10،11،12</…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وليس لدى أصحاب البلاغ أي إقرارات.
Materials
| 1.5 mL and 2 mL polypropylene twist-lock tubes (DNase-, RNase-, DNA-, PCR inhibitor-free) | Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR | ||
| Absolute Ethanol (quality of analytical degree) | Reagent required for DNA extraction | ||
| Benchtop centrifuge | Maximum speed of 20000 x g. Instrument required for DNA extraction | ||
| EasyPGX analysis software version 2.0.0 | Diatech Pharmacogenetics | RT800-SW | Analysis software |
| EasyPGX centrifuge/vortex 8-well strips | Diatech Pharmacogenetics | RT803 | Instrument recommended for the Real Time PCR assay |
| EasyPGX qPCR instrument 96 | Diatech Pharmacogenetics | RT800-96 | Instrument recommended for the Real Time PCR assay |
| EasyPGX ready FL-DNA | Diatech Pharmacogenetics | RT029 | Kit required for the Real Time PCR assay |
| Micropipettes (volumes from 1 to 1.000 µL) | Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR | ||
| Powder-free disposable gloves | Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR | ||
| QIAamp Fast DNA Stool | Qiagen | 51604 | Kit recommended for the DNA extraction and purification from stool |
| Sterile filter tips DNase-, RNase-free (volumes from 1 to 1.000 µL) | Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR | ||
| Thermal block e.g. EasyPGX dry block | Diatech Pharmacogenetics | RT801 | Instrument required for DNA extraction |
| Vortex e.g. EasyPGX centrifuge/vortex 1.5 ml | Diatech Pharmacogenetics | RT802 | Instrument required for DNA extraction |
Referências
- Fearon, E. R. Molecular Genetics of Colorectal Cancer. Annual Review of Pathology. 6, 479-507 (2011).
- Sears, C. L., Garrett, W. S. Microbes, Microbiota, and Colon Cancer. Cell Host and Microbe. 15, 317-328 (2014).
- Levin, B., et al. Screening and Surveillance for the Early Detection of Colorectal Cancer and Adenomatous Polyps, 2008: A Joint Guideline From the American Cancer Society, the US Multi-Society Task Force on Colorectal Cancer, and the American College of Radiology. Gastroenterology. 134, 1570-1595 (2008).
- Bosch, L. J., et al. Molecular tests for colorectal cancer screening. Clinical Colorectal Cancer. 10, 8-23 (2011).
- Ahlquist, D. A. Molecular detection of colorectal neoplasia. Gastroenterology. 138, 2127-2139 (2010).
- Calistri, D., et al. Fecal multiple molecular tests to detect colorectal cancer in stool. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 1, 377-383 (2003).
- Calistri, D., et al. Detection of colorectal cancer by a quantitative fluorescence determination of DNA amplification in stool. Neoplasia. 6, 536-540 (2004).
- Calistri, D., et al. Quantitative fluorescence determination of long-fragment DNA in stool as a marker for the early detection of colorectal cancer. Cellular Oncology. 31, 11-17 (2009).
- Calistri, D., et al. Fecal DNA for noninvasive diagnosis of colorectal cancer in immunochemical fecal occult blood test-positive individuals. Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. 19, 2647-2654 (2010).
- De Maio, G., et al. Circulating and stool nucleic acid analysis for colorectal cancer diagnosis. World Journal of Gastroenterology. 20, 957-967 (2014).
- Rengucci, C., et al. Improved stool DNA integrity method for early colorectal cancer diagnosis. Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. 23, 2553-2560 (2014).
