Valutazione del rischio di cancro colorettale e della prevalenza da parte del rilevamento dell'integrità del DNA delle feci
Summary
Il kit di diagnostica FL-DNA è un metodo che consente di risparmiare tempo e di utilizzare per determinare la probabilità affidabile della presenza di lesioni del cancro colorettale.
Abstract
Al giorno d’oggi, il DNA delle feci può essere isolato e analizzato con diversi metodi. I lunghi frammenti di DNA nelle feci possono essere rilevati da un test qPCR, che fornisce una probabilità affidabile della presenza di lesioni colorettali pre-neoplastiche o neoplastiche. Questo metodo, chiamato DNA lungo a fluorescenza (FL-DNA), è una procedura veloce e non invasiva che è un miglioramento del sistema di prevenzione primario. Questo metodo si basa sulla valutazione dell’integrità del DNA fecale mediante amplificazione quantitativa di specifici obiettivi del DNA genomico. In particolare, la valutazione di frammenti di DNA più lunghi di 200 bp consente di rilevare pazienti con lesioni colorettali con specificità molto elevata. Tuttavia, questo sistema e tutti i test del DNA delle feci attualmente disponibili presentano alcuni problemi generali che devono essere affrontati (ad esempio, la frequenza con cui devono essere effettuati i test e il numero ottimale di campioni di feci raccolti in ogni momento per ogni individuo). Tuttavia, il principale vantaggio di FL-DNA è la possibilità di usarlo in associazione con un test attualmente utilizzato nel programma di screening CRC, noto come esame del sangue occulto fecale a base immunochimica (iFOBT). Infatti, entrambe le prove possono essere eseguite sullo stesso campione, riducendo i costi e ottenendo una migliore previsione dell’eventuale presenza di lesioni colorettali.
Introduction
Il cancro colorettale (CRC) deriva da un processo a più fasi in cui l’epitelio sano si sviluppa lentamente in adenomi o polipi, che progrediscono in carcinomi maligni nel tempo1,2. Nonostante l’elevato tasso di incidenza del CRC, nell’ultimo decennio3è stata osservata una tendenza al ribasso della percentuale di decessi. Infatti, i primi strumenti diagnostici adottati nei programmi di screening hanno portato alla diagnosi precoce e alla rimozione di adenomas pre-neoplastici o polipi4. Tuttavia, a causa dei diversi limiti tecnici, nessuno di questi metodi è ottimale. Infatti, al fine di migliorare la sensibilità e la specificità, molti test del DNA delle feci sono stati proposti da soli o in combinazione con gli attuali test diagnostici di routine5,6.
Tipicamente, mucosa sana getta nel flusso fecale colonciti apoptotici, mentre mucosa malati esfolia colonciti non apoptotici. Frammenti di 200 bp o più di lunghezza caratterizzano il DNA non apoptotico. Questo DNA è chiamato DNA lungo (L-DNA) ed è diventato un biomarcatore utilizzabile per la diagnosi precoce del CRC. Il L-DNA può essere isolato dal campione di feci e quantificato da qPCR utilizzando un kit in vitro diagnostico FL-DNA7,8,9,10,11,12.
Il test consiste in due analisi per il rilevamento di frammenti di FL-DNA che vanno da 138 bp a 339 bp. Ogni analisi consente l’amplificazione del FL-DNA (FAM) e del DNA spike-in (HEX). Per garantire un’amplificazione ottimale di tutti i frammenti, il test è stato suddiviso in due saggi (denominati “A” e “B”). Il saggio A rileva due regioni dell’esone 14 del gene APC (NM_001127511) e un frammento di esone 7 del gene TP53 (NM_001276760). Il saggio B rileva un frammento di esone 14 del gene APC (NM_001127511) e due regioni di esoni 5 e 8 del gene TP53 (NM_001276760). I saggi non distinguono tra le regioni rilevate. Il DNA spike-in corrisponde al DNA del salmone di Oncorhynchus e consente di verificare che la procedura sia stata eseguita correttamente e che controlli la possibile presenza di inibitori, che possono produrre falsi risultati negativi. La concentrazione di FL-DNA viene valutata mediante quantificazione assoluta utilizzando il metodo della curva standard ed è espressa come ng/reazione.
Il metodo FL-DNA è un test del DNA delle feci non invasivo e poco costoso che, combinato con l’esame del sangue occulto fecale a base immunochimica (iFOBT), è attualmente utilizzato nei programmi di screening CRC e consente migliori previsioni di CRC e/o adenoma lesioni ad alto rischio12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Studi precedenti hanno dimostrato che l’analisi dell’integrità del DNA delle feci estratte da approcci manuali e semiautomatici può rappresentare uno strumento alternativo per la diagnosi precoce delle lesioni colorettali7,8,9,,10,11,12. Nel corso degli anni sono stati sviluppati test molecolari di screening non invasivi pe…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori non hanno alcun riconoscimento.
Materials
| 1.5 mL and 2 mL polypropylene twist-lock tubes (DNase-, RNase-, DNA-, PCR inhibitor-free) | Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR | ||
| Absolute Ethanol (quality of analytical degree) | Reagent required for DNA extraction | ||
| Benchtop centrifuge | Maximum speed of 20000 x g. Instrument required for DNA extraction | ||
| EasyPGX analysis software version 2.0.0 | Diatech Pharmacogenetics | RT800-SW | Analysis software |
| EasyPGX centrifuge/vortex 8-well strips | Diatech Pharmacogenetics | RT803 | Instrument recommended for the Real Time PCR assay |
| EasyPGX qPCR instrument 96 | Diatech Pharmacogenetics | RT800-96 | Instrument recommended for the Real Time PCR assay |
| EasyPGX ready FL-DNA | Diatech Pharmacogenetics | RT029 | Kit required for the Real Time PCR assay |
| Micropipettes (volumes from 1 to 1.000 µL) | Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR | ||
| Powder-free disposable gloves | Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR | ||
| QIAamp Fast DNA Stool | Qiagen | 51604 | Kit recommended for the DNA extraction and purification from stool |
| Sterile filter tips DNase-, RNase-free (volumes from 1 to 1.000 µL) | Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR | ||
| Thermal block e.g. EasyPGX dry block | Diatech Pharmacogenetics | RT801 | Instrument required for DNA extraction |
| Vortex e.g. EasyPGX centrifuge/vortex 1.5 ml | Diatech Pharmacogenetics | RT802 | Instrument required for DNA extraction |
Referências
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