O kit de DNA de DIAGNÓSTICO apresentado é um método de economia de tempo e fácil de usar para determinar a probabilidade confiável da presença de lesões de câncer colorretal.
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Artigo de método
Avaliação do Risco e Prevalência de Câncer Colorretal por Detecção de Integridade do DNA das fezes
Neste artigo
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Resumo
Resumo
Hoje em dia, o DNA das fezes pode ser isolado e analisado por vários métodos. Os longos fragmentos de DNA nas fezes podem ser detectados por um ensaio qPCR, que fornece uma probabilidade confiável da presença de lesões colorretais pré-neoplásicas ou neoplásicas. Este método, chamado DNA longo fluorescência (FL-DNA), é um procedimento rápido e não invasivo que é uma melhoria no sistema de prevenção primário. Este método baseia-se na avaliação da integridade do DNA fecal por amplificação quantitativa de alvos específicos do DNA genômico. Em particular, a avaliação de fragmentos de DNA com mais de 200 bp permite a detecção de pacientes com lesões colorretais com especificidade muito alta. No entanto, este sistema e todos os testes de DNA de fezes disponíveis atualmente apresentam algumas questões gerais que precisam ser abordadas (por exemplo, a frequência em que os testes devem ser realizados e o número ideal de amostras de fezes coletadas em cada ponto de tempo para cada indivíduo). No entanto, a principal vantagem do FL-DNA é a possibilidade de usá-lo em associação com um teste atualmente utilizado no programa de triagem de CRC, conhecido como o exame de sangue oculto fecal à base imunoquímica (iFOBT). De fato, ambos os testes podem ser realizados na mesma amostra, reduzindo custos e obtendo uma melhor previsão da eventual presença de lesões colorretais.
Introdução
O câncer colorretal (CRC) deriva de um processo de várias etapas em que o epitélio saudável lentamente se desenvolve em adenomas ou pólipos, que progridem em carcinomas malignos ao longo do tempo1,,2. Apesar da alta taxa de incidência do CRC, observou-se tendência de queda no percentual de óbitos na última década3. De fato, as ferramentas de diagnóstico precoce adotadas em programas de triagem levaram à detecção e remoção precoce de adenomas pré-neoplásicos ou pólipos4. No entanto, devido aos diferentes limites técnicos, nenhum desses métodos é o ideal. De fato, ....
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Protocolo
Os pacientes foram recrutados no Istituto Scientifico Romagnolo por lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) de Meldola (FC, Itália) entre 2013 e 2015. Os pacientes inscritos estavam no protocolo IRSTB002, aprovado pelo Comitê de Ética do IRST - IRCCS AVR (25/10/2012, ver. 1). Todos os métodos foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos pertinentes. O consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes.
1. Extração de DNA de fezes
- Use um kit para preparar amostras de fezes (ver Tabela de Materiais). Selecione e trate o material fecal realizando a extração de acordo co....
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Resultados
O fluxo de trabalho deste protocolo é mostrado na Figura 1. O fluxo de trabalho fornece duas etapas de controle e ações diferentes de acordo com os resultados desta etapa. Em primeiro lugar, se uma amostra apresenta controles inadequados, a amplificação deve ser repetida. Em segundo lugar, se a amplificação for inibida, a amostra deve ser reprocessada desde o início ou classificada como não valiosa.
A Figura 2 mostra as curvas de fluorescência produzidas por a.......
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Discussão
Estudos anteriores demonstraram que a análise da integridade do DNA das fezes extraídas por abordagens manuais e semiautomáticas pode representar uma ferramenta alternativa para a detecção precoce das lesões colorretais7,,8,,9,,10,,11,,12. Testes de triagem molecular e não invasivo foram desenvolvidos ao longo dos anos para a.......
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Divulgações
Maura Menghi é funcionária em tempo integral da Diatech Pharmacogenetics srl.
Agradecimentos
Os autores não têm reconhecimentos.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubos de polipropileno de 1,5 mL e 2 mL com trava de torção (livre de DNase, RNase, DNA, PCR sem inibidores) | Consumíveis necessários para extração de DNA e PCR em tempo real | ||
| Etanol absoluto (qualidade do grau analítico) | Reagente necessário para extração de DNA | ||
| Centrífuga de bancada | Velocidade máxima de 20000 x g. Instrumento necessário para extração de DNA | ||
| Software de análise EasyPGX versão 2.0.0 | Diatech Pharmacogenetics | RT800-SW | Software de análise |
| Centrífuga/vórtice EasyPGX 8-well strips | Diatech Pharmacogenetics | RT803 | Instrumento recomendado para o ensaio de PCR em tempo real |
| EasyPGX qPCR instrument 96 | Diatech Pharmacogenetics | RT800-96 | Instrumento recomendado para o ensaio de PCR em tempo real |
| EasyPGX pronto FL-DNA | Diatech Pharmacogenetics | RT029 | Kit necessário para o ensaio de PCR em tempo real |
| Micropipetas (volumes de 1 a 1.000 µ L) | Consumíveis necessários para extração de DNA e PCR em tempo real | ||
| descartáveis sem pó | Consumíveis necessários para extração de DNA e PCR em tempo real | ||
| QIAamp Fezes de DNA rápidas | Qiagen | 51604 | Kit recomendado para a extração e purificação de DNA de fezes |
| Pontas de filtro estéreis sem DNase, RNase (volumes de 1 a 1.000 µ L) | Consumíveis necessários para extração de DNA e PCR em tempo real | ||
| Bloco térmico, por exemplo, bloco seco EasyPGX | Diatech Pharmacogenetics | RT801 | Instrumento necessário para extração de DNA |
| Vórtice, por exemplo, centrífuga/vórtice EasyPGX 1,5 ml | RT802 | Diatech Pharmacogenetics | necessário para extração de DNA |
Referências
- Fearon, E. R. Molecular Genetics of Colorectal Cancer. Annual Review of Pathology. 6, 479-507 (2011).
- Sears, C. L., Garrett, W. S. Microbes, Microbiota, and Colon Cancer. Cell Host and Microbe. 15, 317-328 (2014).
- SEER Stat Fact Sheets: Colon and Rectum Cancer. National....
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Reimpressões e permissões
Errata
Formal Correction: Erratum: Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection
Posted by JoVE Editors on 9/28/2020. Citeable Link.
An erratum was issued for: Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection. An affiliation was updated.
The first affiliation was updated from:
Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST)
to:
Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, Meldola, Italy
