便DNA完全性検出による大腸癌リスクと罹患率の評価
Summary
提示された診断FL-DNAキットは、大腸癌病変の存在の信頼性の高い確率を決定するための時間を節約し、ユーザーフレンドリーな方法です。
Abstract
今日では、便DNAは、いくつかの方法で単離し、分析することができます。便中のDNAの長い断片は、前腫瘍性または腫瘍性大腸病変の存在の信頼性の高い確率を提供するqPCRアッセイによって検出することができる。この方法は、蛍光長いDNA(FL-DNA)と呼ばれ、一次予防システム上の改善である迅速で非侵襲的な手順です。この方法は、ゲノムDNAの特異的標的の定量増幅による、便DNA完全性の評価に基づいている。特に、200bpを超えるDNA断片の評価は、非常に高い特異性を有する大腸病変患者の検出を可能にする。しかし、このシステムおよび現在利用可能なすべての便DNA検査は、対処する必要があるいくつかの一般的な問題を提示する(例えば、検査を行う頻度と各個人の各時点で収集された便サンプルの最適な数)。しかし、FL-DNAの主な利点は、免疫化学ベースの便潜血症血液検査(iFOBT)として知られているCRCスクリーニングプログラムで現在使用されている試験と関連してそれを使用する可能性である。実際、両方のテストは、コストを削減し、大腸病変の最終的な存在のより良い予測を達成し、同じサンプルで実行することができます。
Introduction
大腸癌(CRC)は、健康な上皮がゆっくりと腺腫またはポリープに発達する多段階のプロセスから派生し、経時的に悪性癌に進行する11,2。2CRCの高い発生率にもかかわらず、過去10年間で死亡率の低下傾向が観察されました3.実際、スクリーニングプログラムで採用された早期診断ツールは、腫瘍前の腺腫またはポリープの早期発見と除去につながっている4.ただし、技術的な制限が異なるために、これらの方法のどれも最適ではありません。実際、感度と特異性を改善するために、多くの便DNA検査が単独で、または現在のルーチン診断検査55,66と組み合わせて提案されている。
典型的には、健康な粘膜は、アポトーシス大腸細胞の便流に流れ込むが、一方、病気の粘膜は非アポトーシス大腸細胞を剥離する。200bp以上の長さの断片は、非アポトーシスDNAを特徴付ける。このDNAは、ロングDNA(L-DNA)と呼ばれ、CRC早期診断に利用できるバイオマーカーとなっています。L-DNAは便標本から単離し、体外,診断FL-DNA,キット77、8、9、10、11、128,9を用いてqPCRによって定量することができる。10,1112
この試験は、138 bpから339 bpの範囲のFL-DNA断片の検出のための2つのアッセイから構成される。各アッセイは、FL-DNA(FAM)およびスパイクインDNA(HEX)の増幅を可能にします。すべての断片の最適な増幅を確実にするために、検定は2つのアッセイ(“A”と”B”という名前)に分かれています。Aアッセイは、APC遺伝子のエキソン14の2つの領域(NM_001127511)とTP53遺伝子のエキソン7の断片(NM_001276760)を検出する。Bアッセイは、APC遺伝子のエキソン14(NM_001127511)と、TP53遺伝子のエキソン5および8の2つの領域(NM_001276760)の断片を検出する。アッセイは検出された領域を区別しない。スパイクインDNAは、オンコリンコスケタサケサケDNAに対応し、手順が適切に行われていることを検証し、偽陰性の結果をもたらす可能性のある阻害剤の存在をチェックすることができます。FL-DNA濃度は、標準曲線法を用いた絶対定量法で評価され、ng/反応として表されます。
FL-DNA法は、免疫化学的に基づく便潜血検査(iFOBT)と組み合わせて、現在CRCスクリーニングプログラムで使用されており、CRCおよび/または高リスク腺腫病変のより良い予測を可能にする非侵襲的で安価な便DNA検査である。
Protocol
Representative Results
Discussion
これまでの研究では、手動および半自動アプローチによって抽出された便のDNA完全性分析は、大腸病,,,変7、8、9、10、11、128,9の早期発見のための代替ツールを表すことができることが実証されている。7101112分子的、非侵襲的なスクリーニング?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は謝辞を持っていません。
Materials
| 1.5 mL and 2 mL polypropylene twist-lock tubes (DNase-, RNase-, DNA-, PCR inhibitor-free) | Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR | ||
| Absolute Ethanol (quality of analytical degree) | Reagent required for DNA extraction | ||
| Benchtop centrifuge | Maximum speed of 20000 x g. Instrument required for DNA extraction | ||
| EasyPGX analysis software version 2.0.0 | Diatech Pharmacogenetics | RT800-SW | Analysis software |
| EasyPGX centrifuge/vortex 8-well strips | Diatech Pharmacogenetics | RT803 | Instrument recommended for the Real Time PCR assay |
| EasyPGX qPCR instrument 96 | Diatech Pharmacogenetics | RT800-96 | Instrument recommended for the Real Time PCR assay |
| EasyPGX ready FL-DNA | Diatech Pharmacogenetics | RT029 | Kit required for the Real Time PCR assay |
| Micropipettes (volumes from 1 to 1.000 µL) | Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR | ||
| Powder-free disposable gloves | Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR | ||
| QIAamp Fast DNA Stool | Qiagen | 51604 | Kit recommended for the DNA extraction and purification from stool |
| Sterile filter tips DNase-, RNase-free (volumes from 1 to 1.000 µL) | Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR | ||
| Thermal block e.g. EasyPGX dry block | Diatech Pharmacogenetics | RT801 | Instrument required for DNA extraction |
| Vortex e.g. EasyPGX centrifuge/vortex 1.5 ml | Diatech Pharmacogenetics | RT802 | Instrument required for DNA extraction |
Referências
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