Evaluering av kolorektal kreftrisiko og prevalens ved deteksjon av avføring DNA-integritet
Summary
Det presenterte diagnostiske FL-DNA-settet er en tidsbesparende og brukervennlig metode for å fastslå den pålitelige sannsynligheten for tilstedeværelse av kolorektal kreftlesjoner.
Abstract
I dag kan avføring DNA isoleres og analyseres ved hjelp av flere metoder. De lange fragmentene av DNA i avføring kan oppdages av en qPCR-analyse, noe som gir en pålitelig sannsynlighet for tilstedeværelsen av pre-neoplastiske eller neoplastiske kolorektale lesjoner. Denne metoden, kalt fluorescens lang DNA (FL-DNA), er en rask, ikke-invasiv prosedyre som er en forbedring på det primære forebyggende systemet. Denne metoden er basert på evaluering av fekal DNA-integritet ved kvantitativ forsterkning av spesifikke mål for genomisk DNA. Spesielt gjør evalueringen av DNA-fragmenter lenger enn 200 bp det mulig å påvise pasienter med kolorektal lesjoner med svært høy spesifisitet. Imidlertid presenterer dette systemet og alle tilgjengelige avføring DNA-tester noen generelle problemer som må løses (f.eks. hvor ofte tester skal utføres og optimalt antall avføringsprøver samlet inn på hvert tidspunkt for hver enkelt). Den største fordelen med FL-DNA er imidlertid muligheten til å bruke den i forbindelse med en test som for tiden brukes i CRC-screeningprogrammet, kjent som immunkjemisk basert fekal okkult blodprøve (iFOBT). Faktisk kan begge testene utføres på samme prøve, redusere kostnader og oppnå en bedre prediksjon av den endelige tilstedeværelsen av kolorektal lesjoner.
Introduction
Kolorektal kreft (CRC) stammer fra en flertrinnsprosess der sunt epitel sakte utvikler seg til adenomer eller polypper, som utvikler seg til ondartede karsinomer over tid1,,2. Til tross for CRCs høye forekomstrate, har en nedadgående trend i andelen dødsfall blitt observert i løpet av det siste tiåret3. Faktisk har tidlige diagnostiske verktøy vedtatt i screeningprogrammer ført til tidlig deteksjon og fjerning av pre-neoplastiske adenomer eller polypper4. Men på grunn av de forskjellige tekniske grensene, er ingen av disse metodene optimale. Faktisk, for å forbedre følsomhet og spesifisitet, mange avføring DNA-tester har blitt foreslått alene eller i kombinasjon med dagens rutinemessige diagnostiske tester5,6.
Vanligvis strømmer sunne slimhinner inn i fekal strøm apoptotiske kolonicytter, mens syke slimhinner eksfolierer ikke-apoptotiske kolonicytter. Fragmenter av 200 bp eller mer i lengde karakteriserer ikke-apoptotisk DNA. Dette DNA kalles lang DNA (L-DNA) og har blitt en brukbar biomarkør for CRC tidlig diagnose. L-DNA kan isoleres fra avføringsprøve og kvantifiseres av qPCR ved hjelp av et in vitro diagnostisk FL-DNA-sett7,,8,,9,,10,,11,,12.
Testen består av to analyser for påvisning av FL-DNA fragmenter fra 138 bp til 339 bp. Hver analyse tillater forsterkning av FL-DNA (FAM) samt spike-in DNA (HEX). For å sikre optimal forsterkning av alle fragmenter, har testen blitt delt inn i to analyser (kalt “A” og “B”). A-analysen oppdager to regioner av exon 14 av APC genet (NM_001127511) og et fragment av exon 7 av TP53 genet (NM_001276760). B-analysen oppdager et fragment av exon 14 av APC-genet (NM_001127511) og to regioner av exons 5 og 8 av TP53 genet (NM_001276760). Analysene skiller ikke mellom områdene som oppdages. Det spike-in DNA tilsvarer Oncorhynchus keta laks DNA og muliggjør verifisering av at prosedyren er gjort riktig og kontrollerer for mulig tilstedeværelse av inhibitorer, noe som kan gi falske negative resultater. FL-DNA-konsentrasjonen evalueres ved absolutt kvantifisering ved hjelp av standard kurvemetode og uttrykkes som ng/reaksjon.
FL-DNA-metoden er en ikke-invasiv og billig avføring DNA-test som, kombinert med immunkjemisk-basert fekal okkult blodprøve (iFOBT), brukes for tiden i CRC screening programmer og gir bedre spådommer om CRC og / eller høy risiko adenom lesjoner12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tidligere studier har vist at DNA integritet analyse av avføring ekstrahert av manuelle og halvautomatiske tilnærminger kan representere et alternativt verktøy for tidlig påvisning av kolorektal lesjoner7,8,9,10,11,12. Molekylære, ikke-invasive screeningtester har blitt utviklet gjennom årene for påvisning av kolorekta…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne har ingen anerkjennelser.
Materials
| 1.5 mL and 2 mL polypropylene twist-lock tubes (DNase-, RNase-, DNA-, PCR inhibitor-free) | Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR | ||
| Absolute Ethanol (quality of analytical degree) | Reagent required for DNA extraction | ||
| Benchtop centrifuge | Maximum speed of 20000 x g. Instrument required for DNA extraction | ||
| EasyPGX analysis software version 2.0.0 | Diatech Pharmacogenetics | RT800-SW | Analysis software |
| EasyPGX centrifuge/vortex 8-well strips | Diatech Pharmacogenetics | RT803 | Instrument recommended for the Real Time PCR assay |
| EasyPGX qPCR instrument 96 | Diatech Pharmacogenetics | RT800-96 | Instrument recommended for the Real Time PCR assay |
| EasyPGX ready FL-DNA | Diatech Pharmacogenetics | RT029 | Kit required for the Real Time PCR assay |
| Micropipettes (volumes from 1 to 1.000 µL) | Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR | ||
| Powder-free disposable gloves | Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR | ||
| QIAamp Fast DNA Stool | Qiagen | 51604 | Kit recommended for the DNA extraction and purification from stool |
| Sterile filter tips DNase-, RNase-free (volumes from 1 to 1.000 µL) | Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR | ||
| Thermal block e.g. EasyPGX dry block | Diatech Pharmacogenetics | RT801 | Instrument required for DNA extraction |
| Vortex e.g. EasyPGX centrifuge/vortex 1.5 ml | Diatech Pharmacogenetics | RT802 | Instrument required for DNA extraction |
Referências
- Fearon, E. R. Molecular Genetics of Colorectal Cancer. Annual Review of Pathology. 6, 479-507 (2011).
- Sears, C. L., Garrett, W. S. Microbes, Microbiota, and Colon Cancer. Cell Host and Microbe. 15, 317-328 (2014).
- Levin, B., et al. Screening and Surveillance for the Early Detection of Colorectal Cancer and Adenomatous Polyps, 2008: A Joint Guideline From the American Cancer Society, the US Multi-Society Task Force on Colorectal Cancer, and the American College of Radiology. Gastroenterology. 134, 1570-1595 (2008).
- Bosch, L. J., et al. Molecular tests for colorectal cancer screening. Clinical Colorectal Cancer. 10, 8-23 (2011).
- Ahlquist, D. A. Molecular detection of colorectal neoplasia. Gastroenterology. 138, 2127-2139 (2010).
- Calistri, D., et al. Fecal multiple molecular tests to detect colorectal cancer in stool. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 1, 377-383 (2003).
- Calistri, D., et al. Detection of colorectal cancer by a quantitative fluorescence determination of DNA amplification in stool. Neoplasia. 6, 536-540 (2004).
- Calistri, D., et al. Quantitative fluorescence determination of long-fragment DNA in stool as a marker for the early detection of colorectal cancer. Cellular Oncology. 31, 11-17 (2009).
- Calistri, D., et al. Fecal DNA for noninvasive diagnosis of colorectal cancer in immunochemical fecal occult blood test-positive individuals. Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. 19, 2647-2654 (2010).
- De Maio, G., et al. Circulating and stool nucleic acid analysis for colorectal cancer diagnosis. World Journal of Gastroenterology. 20, 957-967 (2014).
- Rengucci, C., et al. Improved stool DNA integrity method for early colorectal cancer diagnosis. Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. 23, 2553-2560 (2014).
