Evaluering af kolorektal cancer risiko og prævalens ved afføring DNA Integrity Detection
Summary
Den præsenterede diagnostiske FL-DNA kit er en tidsbesparende og brugervenlig metode til at bestemme den pålidelige sandsynlighed for tilstedeværelsen af kolorektal cancer læsioner.
Abstract
I dag, afføring DNA kan isoleres og analyseres ved flere metoder. De lange fragmenter af DNA i afføringen kan detekteres ved en qPCR-analyse, som giver en pålidelig sandsynlighed for tilstedeværelsen af prænamplastiske eller neoplastiske kolorektale læsioner. Denne metode, kaldet fluorescens lang DNA (FL-DNA), er en hurtig, ikke-invasiv procedure, der er en forbedring af det primære forebyggelsessystem. Denne metode er baseret på evaluering af fækal DNA-integritet ved kvantitativ forstærkning af specifikke mål for genomisk DNA. Især giver evalueringen af DNA-fragmenter på over 200 bp mulighed for påvisning af patienter med kolorektal læsioner med meget høj specificitet. Dette system og alle i øjeblikket tilgængelige afførings-DNA-test præsenterer imidlertid nogle generelle spørgsmål, der skal løses (f.eks. hvor hyppigt testene skal udføres, og det optimale antal afføringsprøver, der indsamles på hvert tidspunkt for hver enkelt). Den største fordel ved FL-DNA er imidlertid muligheden for at bruge det sammen med en test, der i øjeblikket anvendes i CRC-screeningprogrammet, kendt som den immunkemiske fækal okkulte blodprøve (iFOBT). Faktisk kan begge test udføres på den samme prøve, hvilket reducerer omkostningerne og opnå en bedre forudsigelse af den endelige tilstedeværelse af kolorektal læsioner.
Introduction
Kolorektal cancer (CRC) stammer fra en multi-trinsproces,hvor sund epitel langsomt udvikler sig til adenomer eller polypper, som udvikler sig til maligne karcinomer over tid1,2. På trods af CRC’s høje incidensrate er der observeret en nedadgående tendens i andelen af dødsfald i løbet af det seneste årti3. Faktisk, tidlig diagnostiske værktøjer vedtaget i screening programmer har ført til tidlig påvisning og fjernelse af præ-neoplastiske adenomer eller polypper4. Men på grund af de forskellige tekniske grænser er ingen af disse metoder optimale. For at forbedre følsomheden og specificiteten er mange afførings-DNA-test blevet foreslået alene eller i kombination med de nuværende rutinemæssige diagnostiske test5,6.
Typisk, sund slimhinde kaster ind i fækal strøm apoptotiske kolocytter, mens syge slimhinde eksfolierer ikke-apoptotiske colonocytes. Fragmenter på 200 bp eller mere i længden karakteriserer ikke-apoptotisk DNA. Dette DNA kaldes lang DNA (L-DNA) og er blevet en utilizable biomarkør for CRC tidlig diagnose. L-DNA’et kan isoleres fra afføringsprøven og kvantificeres ved qPCR ved hjælp af et in vitro-diagnostisk FL-DNA-sæt7,8,9,10,11,12.
Testen består af to analyser til påvisning af FL-DNA-fragmenter fra 138 bp til 339 bp. Hver analyse tillader forstærkning af FL-DNA (FAM) samt spike-in DNA (HEX). For at sikre optimal forstærkning af alle fragmenter er testen opdelt i to analyser (kaldet “A” og “B”). A-analysen registrerer to regioner af exon 14 af APC-genet (NM_001127511) og et fragment af exon 7 af TP53-genet (NM_001276760). B-analysen registrerer et fragment af exon 14 af APC-genet (NM_001127511) og to regioner med exoner 5 og 8 i TP53-genet (NM_001276760). Analysen skelner ikke mellem de fundne regioner. Den spike-in DNA svarer til Oncorhynchus keta laks DNA og gør det muligt at kontrollere, at proceduren er blevet gjort korrekt, og kontrol for den mulige tilstedeværelse af inhibitorer, som kan give falske negative resultater. FL-DNA-koncentrationen evalueres ved absolut kvantificering ved hjælp af standardkurvemetoden og udtrykkes som ng/reaktion.
FL-DNA-metoden er en ikke-invasiv og billig afføring DNA-test, der kombineret med den immunokemiske-baserede fækal okkult blodprøve (iFOBT), er i øjeblikket anvendes i CRC screening programmer og giver mulighed for bedre forudsigelser af CRC og / eller høj risiko adenom læsioner12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tidligere undersøgelser har vist , at DNA-integritetsanalyse af afføring , der er udvundet ved manuelle og halvautomatiske tilgange , kan udgøre et alternativt redskab til tidlig påvisning af kolorektale læsioner7,8,9,10,11,12. Molekylære, noninvasive screeningtest er blevet udviklet i årenes løb til påvisning af kol…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne har ingen anerkendelser.
Materials
| 1.5 mL and 2 mL polypropylene twist-lock tubes (DNase-, RNase-, DNA-, PCR inhibitor-free) | Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR | ||
| Absolute Ethanol (quality of analytical degree) | Reagent required for DNA extraction | ||
| Benchtop centrifuge | Maximum speed of 20000 x g. Instrument required for DNA extraction | ||
| EasyPGX analysis software version 2.0.0 | Diatech Pharmacogenetics | RT800-SW | Analysis software |
| EasyPGX centrifuge/vortex 8-well strips | Diatech Pharmacogenetics | RT803 | Instrument recommended for the Real Time PCR assay |
| EasyPGX qPCR instrument 96 | Diatech Pharmacogenetics | RT800-96 | Instrument recommended for the Real Time PCR assay |
| EasyPGX ready FL-DNA | Diatech Pharmacogenetics | RT029 | Kit required for the Real Time PCR assay |
| Micropipettes (volumes from 1 to 1.000 µL) | Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR | ||
| Powder-free disposable gloves | Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR | ||
| QIAamp Fast DNA Stool | Qiagen | 51604 | Kit recommended for the DNA extraction and purification from stool |
| Sterile filter tips DNase-, RNase-free (volumes from 1 to 1.000 µL) | Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR | ||
| Thermal block e.g. EasyPGX dry block | Diatech Pharmacogenetics | RT801 | Instrument required for DNA extraction |
| Vortex e.g. EasyPGX centrifuge/vortex 1.5 ml | Diatech Pharmacogenetics | RT802 | Instrument required for DNA extraction |
Referências
- Fearon, E. R. Molecular Genetics of Colorectal Cancer. Annual Review of Pathology. 6, 479-507 (2011).
- Sears, C. L., Garrett, W. S. Microbes, Microbiota, and Colon Cancer. Cell Host and Microbe. 15, 317-328 (2014).
- Levin, B., et al. Screening and Surveillance for the Early Detection of Colorectal Cancer and Adenomatous Polyps, 2008: A Joint Guideline From the American Cancer Society, the US Multi-Society Task Force on Colorectal Cancer, and the American College of Radiology. Gastroenterology. 134, 1570-1595 (2008).
- Bosch, L. J., et al. Molecular tests for colorectal cancer screening. Clinical Colorectal Cancer. 10, 8-23 (2011).
- Ahlquist, D. A. Molecular detection of colorectal neoplasia. Gastroenterology. 138, 2127-2139 (2010).
- Calistri, D., et al. Fecal multiple molecular tests to detect colorectal cancer in stool. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 1, 377-383 (2003).
- Calistri, D., et al. Detection of colorectal cancer by a quantitative fluorescence determination of DNA amplification in stool. Neoplasia. 6, 536-540 (2004).
- Calistri, D., et al. Quantitative fluorescence determination of long-fragment DNA in stool as a marker for the early detection of colorectal cancer. Cellular Oncology. 31, 11-17 (2009).
- Calistri, D., et al. Fecal DNA for noninvasive diagnosis of colorectal cancer in immunochemical fecal occult blood test-positive individuals. Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. 19, 2647-2654 (2010).
- De Maio, G., et al. Circulating and stool nucleic acid analysis for colorectal cancer diagnosis. World Journal of Gastroenterology. 20, 957-967 (2014).
- Rengucci, C., et al. Improved stool DNA integrity method for early colorectal cancer diagnosis. Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. 23, 2553-2560 (2014).
