मानव ंयूरॉंस के लेंटवायरल-मध्यस्थता ट्रांक्शन का उपयोग कर ताऊ एकत्रीकरण का अध्ययन करने के लिए एक इन विट्रो मॉडल
Summary
इस प्रोटोकॉल का विवरण एक प्रक्रिया है जिसमें मानव न्यूरोनल संस्कृतियों उत्परिवर्ती मानव ताऊ के लिए कोडिंग के साथ लेंट्रोवायरल constructs के साथ transduced हैं । Transduced संस्कृतियों ताऊ समुच्चय और संबंधित विकृतियों प्रदर्शित करते हैं ।
Abstract
प्रोटीन का aberrant एकत्रीकरण ताऊ pathogenically अल्जाइमर रोग (एडी) सहित न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों की एक संख्या में शामिल है । हालांकि tauopathy के माउस मॉडल एकत्रित ताऊ के तंत्रिआविषी तंत्र की जांच के लिए एक मूल्यवान संसाधन प्रदान की है, यह तेजी से स्पष्ट होता जा रहा है कि, neuroफिजियोलॉजी में interspecies मतभेदों के कारण, माउस मस्तिष्क के लिए अनुपयुक्त है मानव शर्त मॉडलिंग । कोशिका संस्कृति के तरीकों में अग्रिम मानव न्यूरोनल संस्कृतियों में प्रयोगात्मक उपयोग के लिए सुलभ बना दिया है विट्रो और neurotherapeutics के विकास में सहायता प्राप्त है. हालांकि, मानव न्यूरोनल कोशिका संस्कृतियों के अनुकूलन के बावजूद, मानव tauopathy के इन विट्रो मॉडल अभी तक व्यापक रूप से उपलब्ध नहीं हैं । इस प्रोटोकॉल ताऊ एकत्रीकरण के एक सेलुलर मॉडल का वर्णन करता है जिसमें मानव ंयूरॉंस के साथ transduced कर रहे है के साथ एक एक पीला फ्लोरिसेंट प्रोटीन (yfp) के लिए रोगजनक उत्परिवर्तित ताऊ के लिए कोड । Transduced संस्कृतियों ताऊ समुच्चय का उत्पादन है कि thioflavin और neurotoxicity के प्रदर्शन मार्कर के लिए सकारात्मक दाग, जैसे अक्षीय लंबाई और वृद्धि हुई लाइसोसोमल मात्रा के रूप में । यह प्रक्रिया मानव tauopathies के अध्ययन के लिए एक उपयोगी और लागत प्रभावी मॉडल हो सकता है ।
Introduction
माइक्रोटयूब से संबंधित प्रोटीन ताउ का रोगात्मक समुच्चय अनेक न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों का एक निर्धारक लक्षण है, जिनमें एडी, फ्रन्टोटेम्पोरल मनोभ्रंश (एफटीडी), पिक की बीमारी, और प्रगतिशील सुप्रानाभिकीय अंगघात (पीएसपी)1शामिल हैं । एक रोगग्रस्त अवस्था में ताऊ, न्यूरोनल एक्सऑन्स2में माइक्रोट्यूब्यूल तंतु को बाँधता है और स्थिर करता है । तथापि, ताऊ का रोग-संबद्ध हाइपरफॉस्फोरीलेशन ताऊ एकत्रीकरण, माइक्रोट्यूब्यूल्स से वियोजन और न्यूरोनल विषाक्तता3को बढ़ावा देता है । एकत्रित ताऊ के विषाक्त प्रभाव कोलीनर्जिक4 और ग्लूटामैटेजिक रिसेप्टर्स के ंयायपालिका सक्रियण शामिल हो सकते हैं5 intracellular कैल्शियम के डिस्रेग्युलेशन में जिसके परिणामस्वरूप और, अंत में, कोशिका मृत्यु. पशु मॉडल में, मस्तिष्क ताऊ की कमी विज्ञापन चूहों6 और दोहराव हल्के अभिघातजंय मस्तिष्क चोट7के माउस मॉडल में विकृति में सुधार ।
बढ़ते सबूत दर्शाता है कि संरचना और माउस की बाध्यकारी संबध-ताऊ व्युत्पंन मानव ताऊ से व्युत्पंन और है कि माउस ताऊ मानव tauopathies8मॉडलिंग के लिए अनुपयुक्त है । हालांकि, मानव कोशिका तौलविकृति मॉडल व्यापक रूप से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं हैं । इस काम का समग्र लक्ष्य ताऊ एकत्रीकरण के इन विट्रो मॉडल का वर्णन करना है जिसमें मानव न्यूरॉन्स को मटैन्ट मानव ताऊ से युक्त लैंटवायरल व्युत्पन्न वैक्टर के साथ ट्रांसड्यूडेड किया जाता है । ताउ के कारण एक प्रकार का फल, ताउ दोहराने डोमेन के लिए encodes P301L और V337M म्यूटेशन एक yfp रिपोर्टर (ताऊ-rdlm-yfp) जबकि नियंत्रण के लिए कोड constructs जंगली तरह (wt) ताऊ दोहराने डोमेन के लिए एक yfp रिपोर्टर (ताऊ-wt-yfp) संगलित । Neuronal संस्कृतियों इस विधि का उपयोग कर transduced लगभग नौ बार और nontransduced संस्कृतियों से अधिक ताऊ व्यक्त करते हैं । हालांकि ताऊ अभिव्यक्ति की राशि है, ताऊ-RDLM-YFP-और ताऊ-Wt-YFP-transduced कोशिकाओं के बीच मोटे तौर पर बराबर है, केवल ंयूरॉंस ताऊ-RDLM-YFP प्रदर्शन समुच्चय के साथ transduced । ताउ के साथ transduced-RDLM-YFP थायोफ्लेविन के लिए सकारात्मक दाग और axonal लंबाई और synaptic घनत्व में कटौती प्रदर्शन । इसलिए, यह सेलुलर मॉडल ताऊ एकत्रीकरण इन विट्रो का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण हो सकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह प्रोटोकॉल मानव तौपविकृति के एक इन विट्रो मॉडल की उत्पत्ति का वर्णन करता है जो सिल्वर-दाग-धनात्मक समुच्चय और थायोफ्लेविन-पॉजिटिव न्यूरोफाइनेन्शिलरी कोणों (एनएफएफटी) को दर्शाती है । इसके अलावा, transduced …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों को डॉ पीटर Davies शुक्रिया अदा करना चाहूंगा अल्बर्ट आइंस्टीन कॉलेज ऑफ मेडिसिन में PHF-1 और CP13 एंटीबॉडी और डॉ मार्क डायमंड की आपूर्ति के लिए टेक्सास, साउथैवेस्टर्न विश्वविद्यालय में, ताऊ constructs प्रदान करने के लिए । यह काम अल्जाइमर एसोसिएशन (NIRG-14-322164) से अनुदान के लिए S.H.Y. और कैलिफोर्निया संस्थान से पुनर्योजी चिकित्सा के लिए (TB1-01193) पीआर को समर्थन किया गया था
Materials
| 10 cm culture dishes | Thermofisher | 12556002 | |
| 15 ml tubes | Biopioneer | CNT-15 | |
| 16% paraformaldehyde | Thermofisher | 50-980-487 | |
| 24 well culture plates | Thermofisher | 930186 | |
| 50ml tubes | Biopioneer | CNT-50 | |
| 70% ethanol in spray bottle | Various sources | NA | |
| B27 supplement | Thermofisher | 17504044 | |
| Basement membrane matrix (Matrigel) | Corning | 356231 | |
| Basic FGF | Biopioneer | HRP-0011 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| Cell culture incubator | Various sources | NA | |
| Centrifuge | Various sources | NA | |
| DMEM-F12 culture media with glutamine | Thermofisher | 10565042 | |
| Ethanol (50% concentration or higher) | Various sources | NA | |
| Flourescently labeled secondary antibodies | Various Sources, experiment dependent | NA | |
| Fluorescent microscope | Various sources | NA | |
| Glass coverslips | Thermofisher | 1254581 | |
| Glass slides | Thermofisher | 12-550-15 | |
| Human neural stem cells | Various sources | NA | |
| Lentiviral vectors | Various sources | custom order | |
| Mounting media | Thermofisher | P36934 | |
| N2 supplement | Thermofisher | 17502048 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermofisher | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline | Thermofisher | 14190250 | |
| Primary antibodies | Various Sources, experiment dependent | NA | |
| Rocking or rotating platform | Various sources | NA | |
| Sterile cell culture hood | Various sources | NA | |
| Thioflavin S | Sigma | T1892-25G | |
| Triton X-100 | Thermofisher | BP151-100 | |
| Water bath | Various sources | NA |
Referências
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