JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Imunologia e Infecção

Шаблон-Triggered Окислительный взрыв и рассады Ингибирование роста Анализы в Arabidopsis талиана

Published: May 21, 2019
doi:
10.3791/59437
, , ,
1Department of Biology,Queen’s University

Summary

В настоящем документе описаны два метода количественной оценки ответов на защиту в Arabidopsis thaliana после воздействия иммунных вырезов: преходящий окислительный всплеск и ингибирование роста рассады.

Abstract

Растения развили надежную иммунную систему, чтобы воспринимать патогенные микроорганизмы и защищать от болезней. В этой статье описаны два анализа, которые могут быть использованы для измерения силы иммунной активации в Arabidopsis thaliana после лечения с молекулами выжидателя. Представленпервый первый метод для захвата быстро индуцированного и динамического окислительного всплеска, который может контролироваться с помощью наблюдения на основе люминола. Представлен второй метод, описывающий, как измерить иммунно-индуцированного ингибирования роста рассады. Эти протоколы являются быстрыми и надежными, не требуют специальной подготовки или оборудования, и широко используются для понимания генетической основы иммунитета растений.

Introduction

Чтобы воспринимать и защищать от патогенных микроорганизмов, растения эволюционировали мембраны связаны рецепторы распознавания образов (PRRs), которые обнаруживают сохраненные молекулы микробов за пределами клетки, известные как микроб связанных молекулярных моделей (MAMPs)1. Привязка MAMPs к их cognate PRRs инициирует протеин киназы-опосредованную иммунную сигнализацию, приводящую к устойчивости болезни широкого спектра2. Одной из самых ранних реакций после активации PRR является фосфорилирование и активация интегральной плазменной мембраны RESPIRATORY BURST OXIDASE HOMOLOG (RBOH) белков, которые катализморают производство внеклеточных реактивных видов кислорода (ROS)3 , 4. ROS играют важную роль в установлении устойчивости к болезням, действуя как вторичные посланники для распространения иммунной сигнализации, а также прямые противомикробные агенты5. Первое наблюдение иммунно-elicited окислительного всплеска был описан с использованием клубней картофеля cv. Rishiri после Phytophthora infestans прививки6. ROS производство было оценено в несколькихвидов растений с использованием листовых дисков 7, клеточной суспензии культур8, и протопласты6. Описанный здесь простой метод для assaying шаблон-спровоцированный производство ROS в листовых дисках Arabidopsis thaliana (Arabidopsis).

В ответ на восприятие MAMP, активированные белки RBOH катализируют производство супероксидных радикалов (O2– ),гидроксиловые радикалы (ЗОХ) и синглетного кислорода (1O2), которые преобразуются в перекись водорода (H2O 2)во внеклеточном пространстве9. H2O2 может быть количественно люминол основе химилюминесценции в присутствии окислительного агента хрен пероксидаза (HRP)10. HRP окисляет H2O2 генерации гидроксидного иона (OH)и кислородного газа (O2), которые реагируют с люминолом для получения нестабильного промежуточного, который выпускает фотон света10. Фотон-излучение может быть количественно оценено как относительные световые единицы (RLUs) с помощью микроплитного считывателя или изображения, способного обнаруживать люминесценцию, которая стала стандартным оборудованием в большинстве молекулярных лабораторий. Путем измерять свет произведенный над интервалом 40-60 минут, преходящий окислительный взрыв можно обнаружить уже через 2-5 минут после обработки вымлитора, достигая пика на 10-20 минутах, и возвращающ к базальным уровням после q60 минут11. Кумулятивный свет, производимый в течение этого времени, может быть использован в качестве меры иммунной силы, соответствующей активации белков RBOH12. Удобно, что этот анализ не требует специализированного оборудования или громоздкой подготовки образца.

Пик вскоре после обнаружения MAMP, окислительный всплеск считается ранним иммунным ответом, наряду с активацией MAPK и производством этилена5. Позже иммунные реакции включают транскрипционного перепрограммирования, стоматальное закрытие, и осаждение клилоза2,5. Длительное воздействие MAMPs постоянно активирует энергично-дорогостоящие иммунные сигнализации в результате ингибирования роста растений, что свидетельствует о компромиссе между развитием и иммунитетом13. Шаблон триггеров роста саженцев (SGI) широко используется для оценки иммунной продукции в Арабидопсис и был неотъемлемой частью выявления нескольких ключевых компонентов иммунной сигнализации, включая PRRs14,15 ,16. Таким образом, в этой статье дополнительно представлена ассс для шаблона срабатывает SGI в Arabidopsis, в котором саженцы выращиваются в нескольких колодцев, содержащих стандартные средства массовой информации или средств массовой информации дополняется иммунной выдыхатель в течение 8-12 дней, а затем весил с помощью аналитической шкалы.

Чтобы продемонстрировать, как ROS и SGI анализы могут быть использованы для мониторинга PRR-опосредованной сигнализации, три генотипа, которые представляют различные иммунные выходы были выбраны: (1) дикий тип Arabidopsis присоединения Колумбии (Col-0), (2) доминирующей отрицательной bak1-5 мутант, в котором многофункциональный PRR ко-рецептор BRASSINOSTEROID INSENSITIVE 1-АССОЦИированный КИНАС1 (BAK1) является нефункциональным в иммунной сигнализации17,18,и (3) рецессивный cpk28-1 мутант, который не хватает регуляторный белок CALCIUM-DEPENDENT PROTEIN KINASE 28 (CPK28) и отображает повышенные иммунные реакции19,20. ROS и SGI анализы представлены в ответ на синтетически производства эльф18 пептид эпитоп бактериального фактора удлинения Ту (EF-Tu), признанных в Arabidopsis PRR EF-Tu RECEPTOR (EFR)15. Эти протоколы могут быть использованы с другими иммунными вылиторами, такими как бактериальная мотилизирующая белка flagellin14 или эндогенных растительных белков elicitor (AtPeps)16, однако, следует отметить, что отзывчивость растений отличается в зависимости от элицитор21. Вместе, ROS и SGI анализы могут быть использованы для быстрой и количественной оценки ранних и поздних PRR-опосредованных ответов.

Protocol

1. Обнаружение ВСПЛЕСКа ROS в дисках листьев Arabidopsis после иммунной выскания Рост и техническое обслуживание растений. Чтобы синхронизировать прорастание, расслоите семена арабидопсиса, приостановив около 50 семян в 1 мл стерильных 0,1% агара и хранить при 4 градусах Цельс…

Representative Results

Мутант cpk28-119,25 и bak1-517,18 растений были использованы для демонстрации ожидаемых результатов для генотипов с высокими и низкими иммунными реакциями, соответственно, при окислительном взрыве и SGI ан…

Discussion

В настоящем документе описаны два метода для оценки шаблона триггерных иммунных реакций в Arabidopsis, предлагая количественные подходы к оценке иммунной продукции без использования специализированного оборудования. В сочетании, срабатывающие шаблонЫ ROS и SGI могут быть использованы д…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Работа в нашей лаборатории финансируется через Природные ресурсы и инженерные исследования Совета Канады (NSERC) Discovery Program, Канадский фонд инноваций Джон Р. Эванс Лидер фонда, и Королевский университет. KS и IS поддерживаются тандемом Онтарио аспирантские стипендии и NSERC Канада стипендии для студентов магистра (CGS-M).

Materials

20-20-20 Fertilizer Plant Prod 10529 Mix 1g/L in water and apply to plants every 2 weeks for optimal growth.
4 mm Biopsy Punch Medical Mart 232-33-34-P A cork borer set with a 0.125 cm^2 surface area can also be used.
48-Well Sterile Plates with Lid Sigma-Aldrich CLS3548
Analytical Scale with Draft Sheid VWR VWR-225AC Any standard analytical scale can be used for growth inibition assays, however, a direct computer output is optimal.
BioHit mLine Mechanical 12 Multichannel Pipette (30-300 uL) Sartorius 725240 Any multichannel pipette can be used, as can a single pipetter if necessary.
elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG) EZ Biolab cp7211 Store 10 mM stock peptide at -80C in low protein binding tubes. When thawed, store 100 uM working stock at -20C.
Forceps Fisher Scientific 22-327379
Horseradish Peroxidase Sigma-Aldrich P6782 Dissolve in pure water. Store at -20C and away from light.
Luminol Sigma-Aldrich A8511 Dissolve in DMSO. Store at -20C and away from light.
Murisage and Skoog Basal Salts Cedarlane Labs MSP09-100LT Store at 4C.
Soil SunGrow Horticulture Sunshine Mix #1 Other soil types can also be used to grow Arabidopsis. Mix with water when filling pots.
SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader with LUM Module Molecular Devices Must request a quote Any plate reader capable of detecting luminescence can be used for these assays.
Sucrose Sigma-Aldrich S0389-1KG Store at room temperature.
White Polystyrene 96-Well Plates Fisher Scientific 07-200-589
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Couto, D. E., Zipfel, C. Regulation of pattern recognition receptor signalling in plants. Nature Reviews Immunology. 16, 537-552 (2016).
  2. Boller, T., Felix, G. A Renaissance of Elicitors: Perception of Microbe-Associated Molecular Patterns and Danger Signals by Pattern-Recognition Receptors. Annual Review of Plant Biology. 60, 379-406 (2009).
  3. Marino, D., Dunand, C., Puppo, A., Pauly, N. A burst of plant NADPH oxidases. Trends in Plant Science. 56 (8), 1472-1480 (2012).
  4. Kadota, Y., Shirasu, K., Zipfel, C. Regulation of the NADPH Oxidase RBOHD during Plant Immunity. Plant and Cell Physiology. 56 (8), 1472-1480 (2015).
  5. Yu, X., Feng, B., He, P., Shan, L. From chaos to harmony: responses and signaling upon microbial pattern recognition. Annual Review of Phytopathology. 55, 109-137 (2017).
  6. Doke, N. Involvement of superoxide anion generation in the hypersensitive response of potato tuber tissues to infection with an incompatible race of Phytophthora infestans and to the hyphal wall components. Physiological Plant Pathology. 23 (3), 345-357 (1983).
  7. Bindschedler, L. V., et al. Peroxidase-dependent apoplastic oxidative burst in Arabidopsis required for pathogen resistance. The Plant Journal. 47 (6), 851-863 (2006).
  8. Keppler, L. D. Active Oxygen Production During a Bacteria-Induced Hypersensitive Reaction in Tobacco Suspension Cells. Phytopathology. 110 (3), 759-763 (1989).
  9. Wrzaczek, M., Brosché, M., Kangasjärvi, J. ROS signaling loops – production, perception, regulation. Current Opinion in Plant Biology. 16 (5), 575-582 (2013).
  10. Warm, E., Laties, G. G. Quantification of hydrogen peroxide in plant extracts by the chemiluminescence reaction with luminol. Phytochemistry. 21 (4), 827-831 (1982).
  11. Trujillo, M. Analysis of the lmmunity-Related Oxidative Bursts by a Luminol-Based Assay. Methods in Molecular Biology. 1398, 323-329 (2016).
  12. Nühse, T. S., Bottrill, A. R., Jones, A. M. E., Peck, S. C. Quantitative phosphoproteomic analysis of plasma membrane proteins reveals regulatory mechanisms of plant innate immune responses. The Plant Journal. 51 (5), 931-940 (2007).
  13. Belkhadir, Y., Yang, L., Hetzel, J., Dangl, J. L., Chory, J. The growth-defense pivot: Crisis management in plants mediated by LRR-RK surface receptors. Trends in Biochemical Sciences. 39 (10), 447-456 (2014).
  14. Gómez-Gómez, L., Felix, G., Boller, T. A single locus determines sensitivity to bacterial flagellin in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 18 (3), 277-284 (1999).
  15. Zipfel, C., et al. Perception of the Bacterial PAMP EF-Tu by the Receptor EFR Restricts Agrobacterium-Mediated Transformation. Cell. 125 (4), 749-760 (2006).
  16. Krol, E., et al. Perception of the Arabidopsis danger signal peptide 1 involves the pattern recognition receptor AtPEPR1 and its close homologue AtPEPR2. Journal of Biological Chemistry. 285 (18), 13471-13479 (2010).
  17. Schwessinger, B., et al. Phosphorylation-dependent differential regulation of plant growth, cell death, and innate immunity by the regulatory receptor-like kinase BAK1. PLoS Genetics. 7 (4), e1002046 (2011).
  18. Roux, M., et al. The Arabidopsis Leucine-Rich Repeat Receptor-Like Kinases BAK1/SERK3 and BKK1/SERK4 Are Required for Innate Immunity to Hemibiotrophic and Biotrophic Pathogens. The Plant Cell. 23 (6), 2440-2455 (2011).
  19. Monaghan, J., et al. The calcium-dependent protein kinase CPK28 buffers plant immunity and regulates BIK1 turnover. Cell Host and Microbe. 16 (5), 605-615 (2014).
  20. Wang, J., et al. A Regulatory Module Controlling Homeostasis of a Plant Immune Kinase. Molecular Cell. 69 (3), 493-504 (2018).
  21. Mott, G. A., et al. Genomic screens identify a new phytobacterial microbe-associated molecular pattern and the cognate Arabidopsis receptor-like kinase that mediates its immune elicitation. Genome Biology. 17, 98 (2016).
  22. Sang, Y., Macho, A. P. Analysis of PAMP-Triggered ROS Burst in Plant Immunity. Methods in Molecular Biology. 1578, 143-153 (2017).
  23. Smith, J. M., Heese, A. Rapid bioassay to measure early reactive oxygen species production in Arabidopsis leave tissue in response to living Pseudomonas syringae. Plant Methods. 10 (1), 6 (2014).
  24. Lindsey, B. E., Rivero, L., Calhoun, C. S., Grotewold, E., Brkljacic, J. Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds. Journal of Visualized Experiments. 128, (2017).
  25. Matschi, S., Werner, S., Schulze, W. X., Legen, J., Hilger, H. H., Romeis, T. Function of calcium-dependent protein kinase CPK28 of Arabidopsis thaliana in plant stem elongation and vascular development. The Plant Journal. 73 (6), 883-896 (2013).
  26. Felix, G., Duran, J. D., Volko, S., Boller, T. Plants have a sensitive perception system for the most conserved domain of bacterial flagellin. The Plant Journal. 18 (3), 265-276 (2002).
  27. Kunze, G., Zipfel, C., Robatzek, S., Niehaus, K., Boller, T., Felix, G. The N Terminus of Bacterial Elongation Factor Tu Elicits Innate Immunity in Arabidopsis Plants. The Plant Cell. 16 (12), 3496-3507 (2004).
  28. Zipfel, C., et al. Bacterial disease resistance in Arabidopsis through flagellin perception. Nature. 428 (6984), 764-767 (2004).
  29. Mur, L. A. J., Kenton, P., Draper, J. In planta measurements of oxidative bursts elicited by avirulent and virulent bacterial pathogens suggests that H2O2 is insufficient to elicit cell death in tobacco. Plant, Cell and Environment. 28 (4), 548-561 (2005).
  30. Kobayashi, M., et al. Calcium-dependent protein kinases regulate the production of reactive oxygen species by potato NADPH oxidase. The Plant Cell. 19 (3), 1065-1080 (2007).
  31. Yoshioka, H., et al. Induction of Plant gp91 phox Homolog by Fungal Cell Wall, Arachidonic Acid, and Salicylic Acid in Potato. Molecular Plant-Microbe Interactions. 14 (6), 725-736 (2001).
  32. Klauser, D., Flury, P., Boller, T., Bartels, S. Several MAMPs, including chitin fragments, enhance AtPep-triggered oxidative burst independently of wounding. Plant Signaling and Behavior. 8 (9), e25346 (2013).
  33. El Gueddari, N. E., Rauchhaus, U., Moerschbacher, B. M., Deising, H. B. Developmentally regulated conversion of surface-exposed chitin to chitosan in cell walls of plant pathogenic fungi. New Phytologist. 156 (1), 103-112 (2002).
  34. Daiber, A., et al. Detection of superoxide and peroxynitrite in model systems and mitochondria by the luminol analogue L-012. Free Radical Research. 38 (3), 259-269 (2004).
  35. Bauer, Z., Gómez-Gómez, L., Boller, T., Felix, G. Sensitivity of Different Ecotypes and Mutants of Arabidopsis thaliana toward the Bacterial Elicitor Flagellin Correlates with the Presence of Receptor-binding Sites. Journal of Biological Chemistry. 276 (49), 45669-45676 (2001).
  36. Vetter, M. M., et al. Flagellin perception varies quantitatively in arabidopsis thaliana and its relatives. Molecular Biology and Evolution. 29 (6), 1655-1667 (2012).
  37. Chinchilla, D. The Arabidopsis Receptor Kinase FLS2 Binds flg22 and Determines the Specificity of Flagellin Perception. The Plant Cell. 18 (2), 465-476 (2006).
  38. Lloyd, S. R., Schoonbeek, H., Trick, M., Zipfel, C., Ridout, C. J. Methods to Study PAMP-Triggered Immunity in Brassica Species. Molecular Plant-Microbe Interactions. 27 (3), 286-295 (2014).
  39. Clarke, C., Vinatzer, B. Characterizing the Immune-Eliciting Activity of Putative Microbe-Associated Molecular Patterns in Tomato. Methods in Molecular Biology. 1578, 249-261 (2017).
  40. Gimenez-Ibanez, S., Hann, D. R., Chang, J. H., Segonzac, C., Boller, T., Rathjen, J. P. Differential Suppression of Nicotiana benthamiana Innate Immune Responses by Transiently Expressed Pseudomonas syringae Type III Effectors. Frontiers in Plant Science. 9, 688 (2018).
  41. Wei, Y., et al. The Ralstonia solanacearum csp22 peptide, but not flagellin-derived peptides, is perceived by plants from the Solanaceae family. Plant Biotechnology Journal. 16 (7), 1349-1362 (2018).
  42. Melcher, R. L. J., Moerschbacher, B. M. An improved microtiter plate assay to monitor the oxidative burst in monocot and dicot plant cell suspension cultures. Plant Methods. 12, 5 (2016).
  43. Perraki, A., et al. Phosphocode-dependent functional dichotomy of a common co-receptor in plant signalling. Nature. 561 (7722), 248-252 (2018).
  44. Yamaguchi, K., Kawasaki, T. Chitin-Triggered MAPK Activation and ROS Generation in Rice Suspension-Cultured Cells. Methods in Molecular Biology. 1578, 309-316 (2017).
  45. Ortmann, I., Conrath, U., Moerschbacher, B. M. Exopolysaccharides of Pantoea agglomerans have different priming and eliciting activities in suspension-cultured cells of monocots and dicots. FEBS Letters. 580 (18), 4491-4494 (2006).
  46. Ortmann, I., Sumowski, G., Bauknecht, H., Moerschbacher, B. M. Establishment of a reliable protocol for the quantification of an oxidative burst in suspension-cultured wheat cells upon elicitation. Physiological and Molecular Plant Pathology. 64 (5), 227-232 (2004).
  47. Dos Santos, A. L. W., El Gueddari, N. E., Trombotto, S., Moerschbacher, B. M. Partially acetylated chitosan oligo- and polymers induce an oxidative burst in suspension cultured cells of the gymnosperm Araucaria angustifolia. Biomacromolecules. 9 (12), 3411-3415 (2008).
  48. Bressendorff, S., Rasmussen, M., Petersen, M., Mundy, J. Chitin-Induced Responses in the Moss Physcomitrella patens. Methods in Molecular Biology. , 317-324 (2017).
  49. Lloyd, S. R., Ridout, C. J., Schoonbeek, H. Methods to Quantify PAMP-Triggered Oxidative Burst, MAP Kinase Phosphorylation, Gene Expression, and Lignification in Brassicas. Methods in Molecular Biology. 1578, 325-335 (2017).
  50. Gómez-Gómez, L., Boller, T. FLS2: An LRR Receptor-like Kinase involved in the perception of the bacterial elicitor flagellin in Arabidopsis. Molecular Cell. 5 (6), 1003-1011 (2000).
  51. Li, J., et al. Specific ER quality control components required for biogenesis of the plant innate immune receptor EFR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15973-15978 (2009).
  52. Lu, X., et al. Uncoupling of sustained MAMP receptor signaling from early outputs in an Arabidopsis endoplasmic reticulum glucosidase II allele. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (52), 22522-22527 (2009).
  53. Nekrasov, V., et al. Control of the pattern-recognition receptor EFR by an ER protein complex in plant immunity. EMBO Journal. 28 (21), 3428-3438 (2009).
  54. Boutrot, F., et al. Direct transcriptional control of the Arabidopsis immune receptor FLS2 by the ethylene-dependent transcription factors EIN3 and EIL1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (32), 14502-14507 (2010).
  55. Kadota, Y., et al. Direct Regulation of the NADPH Oxidase RBOHD by the PRR-Associated Kinase BIK1 during Plant Immunity. Molecular Cell. 54 (1), 43-55 (2014).

Tags

Keywords: Arabidopsis ThalianaPattern-triggeredOxidative BurstSeedling Growth InhibitionImmune OutputsPlant GenotypesLaboratory EquipmentLeaf DiscsElicitorsReactive Oxygen SpeciesMicroplate ReaderMS MediumSeedling GrowthGrowth Inhibition
check_url/pt/59437?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Bredow, M., Sementchoukova, I., Siegel, K., Monaghan, J. Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (147), e59437, doi:10.3791/59437 (2019).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image