תבנית-המופעל חמצוני ושתיל עיכוב הצמיחה שתילה Assays באריידרופסיס thaliana
Summary
נייר זה מתאר שתי שיטות לכמת את התגובות ההגנה באריידאופזיס thaliana בעקבות החשיפה elicitors החיסונית: פרץ חמצוני חולף, ואת עיכוב צמיחת שתיל.
Abstract
צמחים התפתחו מערכת חיסונית חזקה לתפוס פתוגנים ולהגן מפני מחלה. נייר זה מתאר שתי מטרות שניתן להשתמש בהן כדי למדוד את כוחה של הפעלה חיסונית באריידאופזיס thaliana בעקבות הטיפול עם מולקולות מעורר. מוצג הראשון הוא שיטה ללכידת התפרצות חמצוני במהירות ודינמית, אשר ניתן לפקח באמצעות שיטת הלומירול מבוסס. השני הוא שיטה המתארת כיצד למדוד החיסונית המושרה עיכוב של צמיחת שתיל. פרוטוקולים אלה הם מהירים ואמינים, אינם דורשים הכשרה או ציוד מיוחדים, והם משמשים רבות כדי להבין את הבסיס הגנטי של חסינות הצמח.
Introduction
כדי לתפוס ולהגן מפני פתוגנים, הצמחים התפתחו ממברנה מאוגד הזיהוי דפוסים קולטנים (PRRs) המאתרות מולקולות מיקרוביאלית שימור מחוץ לתא המכונה תבניות מולקולריות הקשורות חיידק (MAMPs)1. הכריכה של mamps כדי קנצוני שלהם prrs יוזם חלבון קינאז-בתיווך איתות החיסונית וכתוצאה מכך עמידות מחלת ספקטרום רחב2. אחת התשובות המוקדם ביותר בעקבות הפעלת PRR הוא זרחון והפעלה של ממברנה בלתי נפרד פלזמה פרץ הומואוקסידאז log (RBOH) חלבונים אשר מזרז את הייצור של מינים חמצן תגובתי לחילוץ (ROS)3 , 4. ROS לשחק תפקיד חשוב בהקמת התנגדות למחלות, משחק הן כמו שליחים משניים להפיץ איתות החיסונית, כמו גם סוכנים מיקרוביאלית ישיר5. התצפית הראשונה של פרץ חמצוני מחוסן מפני החיסון המתואר באמצעות פקעות תפוחי אדמה של קורות חיים. רישירי אחרי Phytophthora … הפקה ROS כבר הוערך מינים צמחים מספר שימוש בדיסקי העלה7, הבולם התרבויות התאים8, ו protoplasts6. המתואר כאן היא שיטה פשוטה עבור הפקת דפוס-הפקה של רוס מופעל דיסקים של העלים של arabidopsis thaliana (arabidopsis).
כתגובה לתפיסה mamp, מופעל חלבונים rboh לזרז את הייצור של רדיקלים סופראוקסיד (O2–), רדיקלים הידרוקסיל (• או), ו סינגתן חמצן (1o2) המומרים חמצן מימן (H2o 2) בחלל החילוץ9. H2O2 ניתן לכמת על-ידי הלומירול מבוססי כימובסנס בנוכחות של הסוכן האוקסיגון חזרת peroxidase (hrp)10. HRP מחמצן2o2 יצירת יון הידרוקסיד (הו-או) וגז חמצן (O2) אשר מגיבים עם הלומירול כדי לייצר ביניים לא יציבה המשחרר פוטון של אור10. פליטת פוטון ניתן לכמת כיחידות אור יחסית (rlus) באמצעות קורא מיקרופלייט או צמידה מסוגל לזהות לומינסנציה, אשר הפכו להיות חלקים סטנדרטיים של ציוד במעבדות המולקולרית ביותר. על ידי מדידת האור המיוצר על פני מרווח 40-60 דקות, פרץ חמצוני חולף ניתן לזהות כבר מוקדם ככל 2-5 דקות לאחר הטיפול הפקה, לשיא ב 10-20 דקות, וחזרה לרמות בסיס אחרי ~ 60 דקות11. האור המצטבר שהופק במהלך הזמן הזה יכול לשמש כמדד של כוח החיסון המתאים להפעלת חלבונים RBOH12. באופן נוח, שיטת הפעולה אינה דורשת ציוד מיוחד או הכנה לדוגמה מסורבלת.
לשיא זמן קצר לאחר זיהוי MAMP, פרץ חמצוני נחשב תגובה חיסונית מוקדמת, יחד עם הפעלה MAMP וייצור אתילן5. מאוחר יותר תגובות החיסון כוללות תכנות משנה, הסגר שיניים, ולהוריד את התצהיר2,5. חשיפה ממושכת למחברי הפרלמנט מפעילה באופן שוטף את האיתות החיסוני אנרגטית-יקר הנובע מעיכוב צמיחת הצמח, הרומז על סחר בין פיתוח לחסינות13. תבנית-המופעל שתיל הצמיחה עיכוב (sgi) משמש רבות כדי להעריך את הפלט החיסונית ב arabidopsis והיה אינטגרלי לזיהוי של מספר רכיבים מרכזיים של איתות החיסון כולל prrs14,15 ,בן 16 לכן, הנייר הזה בנוסף מציג את התשובה עבור מדגם מופעל SGI ב Arabidopsis, לפיו שתילים גדלים בצלחות רב-היטב המכילים מדיה רגילה או מדיה בתוספת מעורר החיסון עבור 8-12 ימים ולאחר מכן שקלת תוך שימוש בקנה מידה אנליטי.
כדי להדגים כיצד ROS ו sgi בחני ניתן להשתמש כדי לפקח על prr בתיווך איתות, שלושה גנוטיפים המייצגים פלטי החיסונית משתנים נבחרו: (1) סוג פראי arabidopsis ההצטרפות קולומביה (Col-0), (2) הדומיננטי-שלילי bak1-5 מוטציה שבה רב תפקודי prr שיתוף קולטן brassinosteroid 1-הקשורים קינאז 1 (BAK1) הוא שאינו פונקציונלי איתות החיסונית17,18, ו (3) המוטציה cpk28-1 , אשר חסרה את ה קינאז חלבון משועבד לחלבונים בחלבון (CPK28) ומציג תגובות מוגברת למערכת החיסונית19,20. ROS ו sgi בחני מוצגים בתגובה מלאכותית המיוצר elf18 פפטיד אפירופה של התארכות בקטריאלי פקטור Tu (EF-tu), מזוהה arabidopsis על ידי הקולטן prr EF-tu (efr)15. פרוטוקולים אלה ניתן להשתמש עם elicitors החיסונית אחרים כגון כותל חלבון בקטריאלי לתנועתיות14 או אנדוגני הצמח מקבל חלבונים (atpeps)16, עם זאת, יש לציין כי תגובתיות הצמח שונה בהתאם ל . מעורר21 יחד, ROS ו sgi בחני יכול לשמש הערכה מהירה וכמותית של תגובות prr מוקדם ומאוחר.
Protocol
Representative Results
Discussion
נייר זה מתאר שתי שיטות לגבי התגובה החיסונית המופעל דפוס ב Arabidopsis, המציע גישות כמותיים להערכת התפוקה החיסונית ללא שימוש בציוד מיוחד. בשילוב, מופעלת תבנית ROS ו SGI ניתן להשתמש כדי להעריך את התגובות מוקדם ומאוחר לתפיסת חיידק, בהתאמה.
המגבלה העיקרית של שיטת פרץ חמצוני היא שינ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
העבודה במעבדה שלנו ממומנת באמצעות המועצה הטבעית של משאבי מחקר והנדסה של קנדה (NSERC) תוכנית דיסקברי, הקרן הקנדית לחדשנות ג’ון R. אוונס קרן מנהיג, ואוניברסיטת המלכה. KS והוא נתמך על ידי מלגות דו-מושביים אונטריו ובוגר NSERC קנדה מלגות לסטודנטים של מאסטר (CGS-M).
Materials
| 20-20-20 Fertilizer | Plant Prod | 10529 | Mix 1g/L in water and apply to plants every 2 weeks for optimal growth. |
| 4 mm Biopsy Punch | Medical Mart | 232-33-34-P | A cork borer set with a 0.125 cm^2 surface area can also be used. |
| 48-Well Sterile Plates with Lid | Sigma-Aldrich | CLS3548 | |
| Analytical Scale with Draft Sheid | VWR | VWR-225AC | Any standard analytical scale can be used for growth inibition assays, however, a direct computer output is optimal. |
| BioHit mLine Mechanical 12 Multichannel Pipette (30-300 uL) | Sartorius | 725240 | Any multichannel pipette can be used, as can a single pipetter if necessary. |
| elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG) | EZ Biolab | cp7211 | Store 10 mM stock peptide at -80C in low protein binding tubes. When thawed, store 100 uM working stock at -20C. |
| Forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Horseradish Peroxidase | Sigma-Aldrich | P6782 | Dissolve in pure water. Store at -20C and away from light. |
| Luminol | Sigma-Aldrich | A8511 | Dissolve in DMSO. Store at -20C and away from light. |
| Murisage and Skoog Basal Salts | Cedarlane Labs | MSP09-100LT | Store at 4C. |
| Soil | SunGrow Horticulture | Sunshine Mix #1 | Other soil types can also be used to grow Arabidopsis. Mix with water when filling pots. |
| SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader with LUM Module | Molecular Devices | Must request a quote | Any plate reader capable of detecting luminescence can be used for these assays. |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389-1KG | Store at room temperature. |
| White Polystyrene 96-Well Plates | Fisher Scientific | 07-200-589 |
Referências
- Couto, D. E., Zipfel, C. Regulation of pattern recognition receptor signalling in plants. Nature Reviews Immunology. 16, 537-552 (2016).
- Boller, T., Felix, G. A Renaissance of Elicitors: Perception of Microbe-Associated Molecular Patterns and Danger Signals by Pattern-Recognition Receptors. Annual Review of Plant Biology. 60, 379-406 (2009).
- Marino, D., Dunand, C., Puppo, A., Pauly, N. A burst of plant NADPH oxidases. Trends in Plant Science. 56 (8), 1472-1480 (2012).
- Kadota, Y., Shirasu, K., Zipfel, C. Regulation of the NADPH Oxidase RBOHD during Plant Immunity. Plant and Cell Physiology. 56 (8), 1472-1480 (2015).
- Yu, X., Feng, B., He, P., Shan, L. From chaos to harmony: responses and signaling upon microbial pattern recognition. Annual Review of Phytopathology. 55, 109-137 (2017).
- Doke, N. Involvement of superoxide anion generation in the hypersensitive response of potato tuber tissues to infection with an incompatible race of Phytophthora infestans and to the hyphal wall components. Physiological Plant Pathology. 23 (3), 345-357 (1983).
- Bindschedler, L. V., et al. Peroxidase-dependent apoplastic oxidative burst in Arabidopsis required for pathogen resistance. The Plant Journal. 47 (6), 851-863 (2006).
- Keppler, L. D. Active Oxygen Production During a Bacteria-Induced Hypersensitive Reaction in Tobacco Suspension Cells. Phytopathology. 110 (3), 759-763 (1989).
- Wrzaczek, M., Brosché, M., Kangasjärvi, J. ROS signaling loops – production, perception, regulation. Current Opinion in Plant Biology. 16 (5), 575-582 (2013).
- Warm, E., Laties, G. G. Quantification of hydrogen peroxide in plant extracts by the chemiluminescence reaction with luminol. Phytochemistry. 21 (4), 827-831 (1982).
- Trujillo, M. Analysis of the lmmunity-Related Oxidative Bursts by a Luminol-Based Assay. Methods in Molecular Biology. 1398, 323-329 (2016).
- Nühse, T. S., Bottrill, A. R., Jones, A. M. E., Peck, S. C. Quantitative phosphoproteomic analysis of plasma membrane proteins reveals regulatory mechanisms of plant innate immune responses. The Plant Journal. 51 (5), 931-940 (2007).
- Belkhadir, Y., Yang, L., Hetzel, J., Dangl, J. L., Chory, J. The growth-defense pivot: Crisis management in plants mediated by LRR-RK surface receptors. Trends in Biochemical Sciences. 39 (10), 447-456 (2014).
- Gómez-Gómez, L., Felix, G., Boller, T. A single locus determines sensitivity to bacterial flagellin in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 18 (3), 277-284 (1999).
- Zipfel, C., et al. Perception of the Bacterial PAMP EF-Tu by the Receptor EFR Restricts Agrobacterium-Mediated Transformation. Cell. 125 (4), 749-760 (2006).
- Krol, E., et al. Perception of the Arabidopsis danger signal peptide 1 involves the pattern recognition receptor AtPEPR1 and its close homologue AtPEPR2. Journal of Biological Chemistry. 285 (18), 13471-13479 (2010).
- Schwessinger, B., et al. Phosphorylation-dependent differential regulation of plant growth, cell death, and innate immunity by the regulatory receptor-like kinase BAK1. PLoS Genetics. 7 (4), e1002046 (2011).
- Roux, M., et al. The Arabidopsis Leucine-Rich Repeat Receptor-Like Kinases BAK1/SERK3 and BKK1/SERK4 Are Required for Innate Immunity to Hemibiotrophic and Biotrophic Pathogens. The Plant Cell. 23 (6), 2440-2455 (2011).
- Monaghan, J., et al. The calcium-dependent protein kinase CPK28 buffers plant immunity and regulates BIK1 turnover. Cell Host and Microbe. 16 (5), 605-615 (2014).
- Wang, J., et al. A Regulatory Module Controlling Homeostasis of a Plant Immune Kinase. Molecular Cell. 69 (3), 493-504 (2018).
- Mott, G. A., et al. Genomic screens identify a new phytobacterial microbe-associated molecular pattern and the cognate Arabidopsis receptor-like kinase that mediates its immune elicitation. Genome Biology. 17, 98 (2016).
- Sang, Y., Macho, A. P. Analysis of PAMP-Triggered ROS Burst in Plant Immunity. Methods in Molecular Biology. 1578, 143-153 (2017).
- Smith, J. M., Heese, A. Rapid bioassay to measure early reactive oxygen species production in Arabidopsis leave tissue in response to living Pseudomonas syringae. Plant Methods. 10 (1), 6 (2014).
- Lindsey, B. E., Rivero, L., Calhoun, C. S., Grotewold, E., Brkljacic, J. Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds. Journal of Visualized Experiments. 128, (2017).
- Matschi, S., Werner, S., Schulze, W. X., Legen, J., Hilger, H. H., Romeis, T. Function of calcium-dependent protein kinase CPK28 of Arabidopsis thaliana in plant stem elongation and vascular development. The Plant Journal. 73 (6), 883-896 (2013).
- Felix, G., Duran, J. D., Volko, S., Boller, T. Plants have a sensitive perception system for the most conserved domain of bacterial flagellin. The Plant Journal. 18 (3), 265-276 (2002).
- Kunze, G., Zipfel, C., Robatzek, S., Niehaus, K., Boller, T., Felix, G. The N Terminus of Bacterial Elongation Factor Tu Elicits Innate Immunity in Arabidopsis Plants. The Plant Cell. 16 (12), 3496-3507 (2004).
- Zipfel, C., et al. Bacterial disease resistance in Arabidopsis through flagellin perception. Nature. 428 (6984), 764-767 (2004).
- Mur, L. A. J., Kenton, P., Draper, J. In planta measurements of oxidative bursts elicited by avirulent and virulent bacterial pathogens suggests that H2O2 is insufficient to elicit cell death in tobacco. Plant, Cell and Environment. 28 (4), 548-561 (2005).
- Kobayashi, M., et al. Calcium-dependent protein kinases regulate the production of reactive oxygen species by potato NADPH oxidase. The Plant Cell. 19 (3), 1065-1080 (2007).
- Yoshioka, H., et al. Induction of Plant gp91 phox Homolog by Fungal Cell Wall, Arachidonic Acid, and Salicylic Acid in Potato. Molecular Plant-Microbe Interactions. 14 (6), 725-736 (2001).
- Klauser, D., Flury, P., Boller, T., Bartels, S. Several MAMPs, including chitin fragments, enhance AtPep-triggered oxidative burst independently of wounding. Plant Signaling and Behavior. 8 (9), e25346 (2013).
- El Gueddari, N. E., Rauchhaus, U., Moerschbacher, B. M., Deising, H. B. Developmentally regulated conversion of surface-exposed chitin to chitosan in cell walls of plant pathogenic fungi. New Phytologist. 156 (1), 103-112 (2002).
- Daiber, A., et al. Detection of superoxide and peroxynitrite in model systems and mitochondria by the luminol analogue L-012. Free Radical Research. 38 (3), 259-269 (2004).
- Bauer, Z., Gómez-Gómez, L., Boller, T., Felix, G. Sensitivity of Different Ecotypes and Mutants of Arabidopsis thaliana toward the Bacterial Elicitor Flagellin Correlates with the Presence of Receptor-binding Sites. Journal of Biological Chemistry. 276 (49), 45669-45676 (2001).
- Vetter, M. M., et al. Flagellin perception varies quantitatively in arabidopsis thaliana and its relatives. Molecular Biology and Evolution. 29 (6), 1655-1667 (2012).
- Chinchilla, D. The Arabidopsis Receptor Kinase FLS2 Binds flg22 and Determines the Specificity of Flagellin Perception. The Plant Cell. 18 (2), 465-476 (2006).
- Lloyd, S. R., Schoonbeek, H., Trick, M., Zipfel, C., Ridout, C. J. Methods to Study PAMP-Triggered Immunity in Brassica Species. Molecular Plant-Microbe Interactions. 27 (3), 286-295 (2014).
- Clarke, C., Vinatzer, B. Characterizing the Immune-Eliciting Activity of Putative Microbe-Associated Molecular Patterns in Tomato. Methods in Molecular Biology. 1578, 249-261 (2017).
- Gimenez-Ibanez, S., Hann, D. R., Chang, J. H., Segonzac, C., Boller, T., Rathjen, J. P. Differential Suppression of Nicotiana benthamiana Innate Immune Responses by Transiently Expressed Pseudomonas syringae Type III Effectors. Frontiers in Plant Science. 9, 688 (2018).
- Wei, Y., et al. The Ralstonia solanacearum csp22 peptide, but not flagellin-derived peptides, is perceived by plants from the Solanaceae family. Plant Biotechnology Journal. 16 (7), 1349-1362 (2018).
- Melcher, R. L. J., Moerschbacher, B. M. An improved microtiter plate assay to monitor the oxidative burst in monocot and dicot plant cell suspension cultures. Plant Methods. 12, 5 (2016).
- Perraki, A., et al. Phosphocode-dependent functional dichotomy of a common co-receptor in plant signalling. Nature. 561 (7722), 248-252 (2018).
- Yamaguchi, K., Kawasaki, T. Chitin-Triggered MAPK Activation and ROS Generation in Rice Suspension-Cultured Cells. Methods in Molecular Biology. 1578, 309-316 (2017).
- Ortmann, I., Conrath, U., Moerschbacher, B. M. Exopolysaccharides of Pantoea agglomerans have different priming and eliciting activities in suspension-cultured cells of monocots and dicots. FEBS Letters. 580 (18), 4491-4494 (2006).
- Ortmann, I., Sumowski, G., Bauknecht, H., Moerschbacher, B. M. Establishment of a reliable protocol for the quantification of an oxidative burst in suspension-cultured wheat cells upon elicitation. Physiological and Molecular Plant Pathology. 64 (5), 227-232 (2004).
- Dos Santos, A. L. W., El Gueddari, N. E., Trombotto, S., Moerschbacher, B. M. Partially acetylated chitosan oligo- and polymers induce an oxidative burst in suspension cultured cells of the gymnosperm Araucaria angustifolia. Biomacromolecules. 9 (12), 3411-3415 (2008).
- Bressendorff, S., Rasmussen, M., Petersen, M., Mundy, J. Chitin-Induced Responses in the Moss Physcomitrella patens. Methods in Molecular Biology. , 317-324 (2017).
- Lloyd, S. R., Ridout, C. J., Schoonbeek, H. Methods to Quantify PAMP-Triggered Oxidative Burst, MAP Kinase Phosphorylation, Gene Expression, and Lignification in Brassicas. Methods in Molecular Biology. 1578, 325-335 (2017).
- Gómez-Gómez, L., Boller, T. FLS2: An LRR Receptor-like Kinase involved in the perception of the bacterial elicitor flagellin in Arabidopsis. Molecular Cell. 5 (6), 1003-1011 (2000).
- Li, J., et al. Specific ER quality control components required for biogenesis of the plant innate immune receptor EFR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15973-15978 (2009).
- Lu, X., et al. Uncoupling of sustained MAMP receptor signaling from early outputs in an Arabidopsis endoplasmic reticulum glucosidase II allele. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (52), 22522-22527 (2009).
- Nekrasov, V., et al. Control of the pattern-recognition receptor EFR by an ER protein complex in plant immunity. EMBO Journal. 28 (21), 3428-3438 (2009).
- Boutrot, F., et al. Direct transcriptional control of the Arabidopsis immune receptor FLS2 by the ethylene-dependent transcription factors EIN3 and EIL1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (32), 14502-14507 (2010).
- Kadota, Y., et al. Direct Regulation of the NADPH Oxidase RBOHD by the PRR-Associated Kinase BIK1 during Plant Immunity. Molecular Cell. 54 (1), 43-55 (2014).
