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Abstract
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Imunologia e Infecção

Ensaios de explosão oxidativa desencadeada por padrão e inibição do crescimento de plântulas em Arabidopsis Arabidopsis thaliana

Published: May 21, 2019
doi:
10.3791/59437
, , ,
1Department of Biology,Queen’s University

Summary

Este trabalho descreve dois métodos para quantificar as respostas de defesa em Arabidopsis Arabidopsis thaliana após a exposição aos elicitors imunes: o estouro oxidativo transiente, e a inibição do crescimento de plântulas.

Abstract

As plantas evoluíram um sistema imunológico robusto para perceber patógenos e proteger contra a doença. Este papel descreve dois ensaios que podem ser usados para medir a força da ativação imune no Arabidopsis thaliana de Arabidopsis que segue o tratamento com moléculas do elicitores. Apresentado em primeiro lugar é um método para capturar o estouro oxidativo rápido-induzido e dinâmico, que pode ser monitorado usando um ensaio luminol-baseado. O segundo apresentado é um método que descreve como medir a inibição imune-induzida do crescimento de plântulas. Estes protocolos são rápidos e de confiança, não exigem o treinamento ou o equipamento especializado, e são amplamente utilizados compreender a base genética da imunidade da planta.

Introduction

Para perceber e se defender contra patógenos, as plantas evoluíram com receptores de reconhecimento de padrões ligados à membrana (PRRs) que detectam moléculas microbianas conservadas fora da célula conhecida como padrões moleculares associados a micróbios (MAMPs)1. A ligação de mamps a seus PRRS cognato inicia a sinalização imune quinase-negociada proteína tendo por resultado a resistência de doença do largo-espectro2. Uma das primeiras respostas após a ativação do PRR é a fosforilação e a ativação de proteínas integrais de membrana plasmática respiratória BURST OXIDASE HOMOLOG (RBOH) que catalisam a produção de espécies reativas de oxigênio extracelular (ROS)3 , 4. Ros desempenham um papel importante no estabelecimento de resistência à doença, atuando tanto como mensageiros secundários para propagar a sinalização imune, bem como agentes antimicrobianos diretos5. A primeira observação de um surto oxidativo imune-eliciado foi descrita usando tubérculos de batata de CV. Rishiri após a inoculação de Phytophthora infestans 6. A produção de Eros foi avaliada em diversas espécies vegetais utilizando discos foliares7, culturas de suspensão celular8e protoplastos6. Descrito aqui é um método simples para a produção de ROS desencadeados por padrão em discos foliares de Arabidopsis Arabidopsis thaliana (Arabidopsis).

Como resposta à percepção MAMP, as proteínas ativadas de RbOH catalisam a produção de radicais de superóxido (o2–), radicais hidroxilo (• Oh) e oxigênio singlet (1o2) que são convertidos em peróxido de hidrogênio (H2o 2) no espaço extracelular9. H2o2 pode ser quantificado por quimioluminescência à base de luminol na presença do agente oxidante peroxidase de rábano (HRP)10. HRP oxida H2O2 gerando um íon hidróxido (Oh−) e gás de oxigênio (O2) que reagem com luminol para produzir um intermediário instável que libera um fóton de luz10. A emissão de fótons pode ser quantificada como unidades de luz relativa (RLUs) usando um leitor de microplacas ou Imager capaz de detectar luminescência, que se tornaram peças padrão de equipamentos na maioria dos laboratórios moleculares. Medindo a luz produzida sobre um intervalo de 40-60 minutos, um estouro oxidativo transiente pode ser detectado tão cedo quanto 2-5 minutos após o tratamento do elicitores, atingindo o pico em 10-20 minutos, e retornando aos níveis básicos após ~ 60 minutos11. A luz cumulativa produzida sobre este curso do tempo pode ser usada como uma medida da força imune que corresponde à ativação de proteínas de RBOH12. Convenientemente, este ensaio não exige o equipamento especializado ou a preparação incômoda da amostra.

Pico logo após a detecção da MAMP, a explosão oxidativa é considerada uma resposta imune precoce, juntamente com a ativação do MAPK e a produção de etileno5. As respostas imunes posteriores incluem reprogramação transcricional, fechamento estomático e deposição de calose2,5. A exposição prolongada aos MAMPs ativa continuamente a sinalização imune energeticamente dispendiosa, resultando na inibição do crescimento vegetal, indicativo de um trade-off entre o desenvolvimento e a imunidade13. A inibição do crescimento de plântulas desencadeada por padrão (SGI) é amplamente utilizada para avaliar a produção imune em Arabidopsis e tem sido parte integrante da identificação de vários componentes-chave da sinalização imune, incluindo PRRS 14,15 ,16. Conseqüentemente, este papel apresenta adicionalmente um ensaio para o SGI Pattern-desencadeado em Arabidopsis, por meio de que as plântulas são crescidas em placas do multi-poço que contêm meios ou meios padrão suplementados com um elicitores imune por 8-12 dias e pesaram então utilizando uma escala analítica.

Para demonstrar como os ensaios ROS e SGI podem ser usados para monitorar a sinalização mediada por PRR, três genótipos que representam diferentes saídas imunes foram escolhidos: (1) o tipo selvagem de adesão de Arabidopsis Columbia (Col-0), (2) o dominante-negativo bak1-5 mutante em que o coreceptor multi-funcional de PRR brassinosteroid insensivel 1-associado quinase 1 (BAK1) é não-funcional na sinalização imune17,18, e (3) o mutante cpk28-1 recessive, que não possui o proteínas reguladoras proteína quinase dependente de cálcio 28 (CPK28) e monitores intensificados respostas imunes-desencadeadas19,20. Os ensaios ROS e SGI são apresentados em resposta a um epítopo de peptídeo elf18 produzido sinteticamente de fator de alongamento bacteriano tu (EF-tu), reconhecido em Arabidopsis pelo receptor PRR EF-tu (EFR)15. Estes protocolos podem ser usados com outros indutores imunes tais como a proteína da motilidade bacteriana flagelina14 ou proteínas endógenas do elicitor da planta (atpeps)16, entretanto, deve-se notar que a responsividade da planta difere dependendo do elicitores21. Juntos, os ensaios ROS e SGI podem ser utilizados para a avaliação rápida e quantitativa das respostas mediadas pelo PRR precoce e tardia.

Protocol

1. detecção de ROS estourou em discos de folhas de Arabidopsis após Elicitação imunológica Crescimento e manutenção de plantas. Para sincronizar a germinação, estratifique as sementes de Arabidopsis suspendendo aproximadamente 50 sementes em 1 ml de agar estéril 0,1% [w/v] e armazene a 4 ° c (sem luz) por 3-4 dias.Nota: estratifique um controle de fundo de tipo selvagem (por exemplo, Col-0) e genótipos com saídas imunes altas e baixas (por exemplo, cpk28-1 e …

Representative Results

Mutantes cpk28-119,25 e bak1-517,18 plantas foram utilizadas para demonstrar os desfechos esperados para genótipos com respostas imunes altas e baixas, respectivamente, em burst oxidativo e SGI ensaios em relação a um controle de fundo de tipo selvagem (Col-0). Para avaliar os efeitos dose-dependentes, uma série de diluição do peptide 10-fold (1-100…

Discussion

Este trabalho descreve dois métodos para a avaliação de respostas imunes desencadeadas por padrão em Arabidopsis, oferecendo abordagens quantitativas para avaliar a produção imune sem o uso de equipamentos especializados. Em combinação, ROS e SGI acionados por padrão podem ser usados para avaliar respostas precoces e tardias à percepção de micródios, respectivamente.

A maior limitação do ensaio de explosão oxidativa é a variabilidade. Por razões que não são complet…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

O trabalho em nosso laboratório é financiado através do programa de descoberta de recursos naturais e engenharia de pesquisa do Canadá (NSERC), a Fundação Canadense para a inovação John R. Evans Leader ‘ s Fund, e da Queen ‘ s University. KS e é são apoiados por tandem Ontario bolsas de pós-graduação e NSERC Canadá bolsas de pós-graduação para estudantes de mestrado (CGS-M).

Materials

20-20-20 Fertilizer Plant Prod 10529 Mix 1g/L in water and apply to plants every 2 weeks for optimal growth.
4 mm Biopsy Punch Medical Mart 232-33-34-P A cork borer set with a 0.125 cm^2 surface area can also be used.
48-Well Sterile Plates with Lid Sigma-Aldrich CLS3548
Analytical Scale with Draft Sheid VWR VWR-225AC Any standard analytical scale can be used for growth inibition assays, however, a direct computer output is optimal.
BioHit mLine Mechanical 12 Multichannel Pipette (30-300 uL) Sartorius 725240 Any multichannel pipette can be used, as can a single pipetter if necessary.
elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG) EZ Biolab cp7211 Store 10 mM stock peptide at -80C in low protein binding tubes. When thawed, store 100 uM working stock at -20C.
Forceps Fisher Scientific 22-327379
Horseradish Peroxidase Sigma-Aldrich P6782 Dissolve in pure water. Store at -20C and away from light.
Luminol Sigma-Aldrich A8511 Dissolve in DMSO. Store at -20C and away from light.
Murisage and Skoog Basal Salts Cedarlane Labs MSP09-100LT Store at 4C.
Soil SunGrow Horticulture Sunshine Mix #1 Other soil types can also be used to grow Arabidopsis. Mix with water when filling pots.
SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader with LUM Module Molecular Devices Must request a quote Any plate reader capable of detecting luminescence can be used for these assays.
Sucrose Sigma-Aldrich S0389-1KG Store at room temperature.
White Polystyrene 96-Well Plates Fisher Scientific 07-200-589
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Keywords: Arabidopsis ThalianaPattern-triggeredOxidative BurstSeedling Growth InhibitionImmune OutputsPlant GenotypesLaboratory EquipmentLeaf DiscsElicitorsReactive Oxygen SpeciesMicroplate ReaderMS MediumSeedling GrowthGrowth Inhibition
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Bredow, M., Sementchoukova, I., Siegel, K., Monaghan, J. Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (147), e59437, doi:10.3791/59437 (2019).
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