JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Imunologia e Infecção

Mönster-utlöst oxidativ burst och Groddplanta tillväxthämning i Arabidopsis thaliana

Published: May 21, 2019
doi:
10.3791/59437
, , ,
1Department of Biology,Queen’s University

Summary

Denna uppsats beskriver två metoder för att kvantifiera försvars svar i Arabidopsis thaliana efter exponering för immunelicitors: den övergående oxidativ bristning, och hämning av plantan tillväxt.

Abstract

Växter har utvecklats ett robust immunförsvar att uppfatta patogener och skydda mot sjukdomar. Denna uppsats beskriver två analyser som kan användas för att mäta styrkan av immunförsvaret aktivering i Arabidopsis thaliana efter behandling med elicitor molekyler. Presenteras först är en metod för att fånga den snabbt inducerad och dynamisk oxidativ burst, som kan övervakas med hjälp av en luminol-baserad analys. Presenteras andra är en metod som beskriver hur man mäter immun-inducerad hämning av plantan tillväxt. Dessa protokoll är snabba och pålitliga, kräver inte specialiserad utbildning eller utrustning, och används i stor utsträckning för att förstå den genetiska grunden för växt immunitet.

Introduction

Att uppfatta och försvara sig mot patogener, växter har utvecklats membran-bundna mönsterigenkänning receptorer (PRRs) som upptäcker bevarade mikrobiella molekyler utanför cellen kallas Microbe-associerade molekylära mönster (MAMPs)1. Bindningen av mamps till deras besläktat PRRS initierar proteinkinas-medierad immun signalering vilket resulterar i bredspektrum sjukdoms resistens2. En av de tidigaste Svaren efter PRR aktiveringen är fosforylering och aktivering av integrerad plasmamembran respiratorisk BURST OXIDAS HOMOLOG (RBOH) proteiner som katalyserar produktionen av extracellulära reaktiva syreradikaler (ROS)3 , 4. ros spelar en viktig roll i att fastställa sjukdoms beständighet, agerar både som sekundära budbärare att propagera immun signalering samt direkta antimikrobiella medel5. Den första observationen av en immunsuppressiva oxidativ explosion beskrevs med hjälp av potatisknölar av CV. Rishiri efter Phytophthora infestans inympning6. ROS produktion har utvärderats i flera växtarter med hjälp av blad skivor7, cellsuspension kulturer8, och protoplasts6. Beskrivs här är en enkel metod för testmetoder mönster-utlöst ros produktion i blad skivor av Arabidopsis thaliana (Arabidopsis).

Som ett svar på MAMP perception, aktiverade rboh proteiner katalysera produktionen av superoxid radikaler (O2–), hydroxylradikaler (• OH), och linne syre (1o2) som omvandlas till väteperoxid (H2o 2) i extracellulära rymden9. H2O2 kan kvantifieras med luminol-baserad chemiluminescens i närvaro av oxidationsmedlet pepparrot PEROXIDAS (HRP)10. HRP oxiderar H2O2 och genererar en HYDROXIDJON (Oh−) och syre gas (O2) som reagerar med luminol för att framställa en instabil intermediär som frigör en fotton av ljus10. Photon emission kan kvantifieras som relativ ljusenheter (RLUs) med hjälp av en mikroplattläsare eller Imager som kan detektera Luminescens, som har blivit standarddelar av utrustning i de flesta molekylära laboratorier. Genom att mäta ljuset som produceras under en 40-60-minuters intervall, en övergående oxidativ burst kan upptäckas så tidigt som 2-5 minuter efter elicitor behandling, topp på 10-20 minuter, och återvänder till basal nivåer efter ~ 60 minuter11. Det kumulativa ljus som produceras under denna tid kurs kan användas som ett mått på immunförsvaret som motsvarar aktiveringen av RBOH proteiner12. Bekvämt, denna analys kräver inte specialiserad utrustning eller besvärliga provberedning.

Peaking kort efter MAMP upptäckt, den oxidativa burst anses vara ett tidigt immunsvar, tillsammans med MAPK aktivering och etenproduktion5. Senare immunsvar inkluderar transkriptionell omprogrammering, stomatala stängning, och callose deposition2,5. Långvarig exponering för MAMPs aktiverar kontinuerligt energiskt kostsamma immun signalering resulterar i hämning av växternas tillväxt, tyder på en avvägningen mellan utveckling och immunitet13. Mönsterutlöst Groddplanta tillväxthämning (SGI) används ofta för att bedöma immun produktionen i Arabidopsis och har varit en integrerad del av identifieringen av flera viktiga komponenter i immun signalering inklusive PRRS14,15 ,16. Därför presenterar detta papper dessutom ett test för mönster-utlöst SGI i Arabidopsis, varvid plantor odlas i multi-well tallrikar som innehåller standardmedier eller media kompletteras med en immun elicitor för 8-12 dagar och sedan vägde med hjälp av en analytisk skala.

För att demonstrera hur ROS-och SGI-analyser kan användas för att övervaka PRR-medierad signalering valdes tre genotyper som representerar olika immun utgångar: (1) Wild Type Arabidopsis anslutning Columbia (Col-0), (2) den dominerande-negativa bak1-5 Mutant där multifunktionell PRR Co-receptor brassinosteroid okänslig 1-associerad Kinas 1 (BAK1) är icke-funktionell i immun signalering17,18, och (3) den recessiv cpk28-1 Mutant, som saknar den reglerande protein kalciumberoende proteinkinas 28 (CPK28) och visar förhöjda immunsuppressiva svar19,20. Analyser av ROS och SGI presenteras som svar på en syntetiskt producerad elf18 peptid epitop av bakteriell Elongation Factor tu (EF-TU), erkänd i Arabidopsis av PRR EF-tu-receptorn (EFR)15. Dessa protokoll kan användas med andra immunologiska elicitorer såsom bakteriell motilitet protein flagellin14 eller endogena växt Elixir proteiner (AtPeps)16, det bör dock noteras att anläggningens reaktionsförmåga varierar beroende på elicitor21. Tillsammans kan ROS-och SGI-analyser användas för snabb och kvantitativ bedömning av tidiga och sena PRR-medierade svar.

Protocol

1. detektion av ROS burst i Arabidopsis löv skivor efter immunelicitation Växternas tillväxt och underhåll. För att synkronisera grobarheten, stratifiera Arabidopsis frön genom att skjuta upp cirka 50 frön i 1 mL steril 0,1% agar [w/v] och förvara vid 4 ° c (ingen ljus) för 3-4 dagar.Notera: stratifiera en Wild typ bakgrundskontroll (till exempel, Col-0) och genotyper med höga och låga immun utgångar (till exempel cpk28-1 och bak1-5, respektive) att f…

Representative Results

Mutant cpk28-119,25 och bak1-517,18 växter användes för att demonstrera förväntade utfall för genotyper med högt och lågt immunsvar, respektive, i oxidativ burst och SGI analyser i förhållande till en Wild-Type bakgrundskontroll (Col-0). För att bedöma dosberoende effekter användes en 10-faldig peptid spädningsserie (1-1000 nM) elf18. Som v?…

Discussion

Denna uppsats beskriver två metoder för testmetoder mönster-utlöst immunsvar i Arabidopsis, erbjuder kvantitativa metoder för att utvärdera immun produktionen utan användning av specialiserad utrustning. I kombination, mönster-utlöst ros och SGI kan användas för att bedöma tidiga och sena svar på mikrob perception, respektive.

Den största begränsningen av den oxidativa burst-analysen är variation. Av skäl som inte är helt klarlagda, absoluta RLUs skiljer sig ofta med…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Arbetet i vårt labb finansieras genom naturresursernas och ingenjörs forskningens råd (NSERC) Discovery program, den kanadensiska Stiftelsen för innovation John R. Evans Leader ‘ s Fund, och Queen ‘ s University. KS och är stöds av tandem Ontario Graduate stipendier och NSERC Kanada Graduate stipendier för masterstudenter (CGS-M).

Materials

20-20-20 Fertilizer Plant Prod 10529 Mix 1g/L in water and apply to plants every 2 weeks for optimal growth.
4 mm Biopsy Punch Medical Mart 232-33-34-P A cork borer set with a 0.125 cm^2 surface area can also be used.
48-Well Sterile Plates with Lid Sigma-Aldrich CLS3548
Analytical Scale with Draft Sheid VWR VWR-225AC Any standard analytical scale can be used for growth inibition assays, however, a direct computer output is optimal.
BioHit mLine Mechanical 12 Multichannel Pipette (30-300 uL) Sartorius 725240 Any multichannel pipette can be used, as can a single pipetter if necessary.
elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG) EZ Biolab cp7211 Store 10 mM stock peptide at -80C in low protein binding tubes. When thawed, store 100 uM working stock at -20C.
Forceps Fisher Scientific 22-327379
Horseradish Peroxidase Sigma-Aldrich P6782 Dissolve in pure water. Store at -20C and away from light.
Luminol Sigma-Aldrich A8511 Dissolve in DMSO. Store at -20C and away from light.
Murisage and Skoog Basal Salts Cedarlane Labs MSP09-100LT Store at 4C.
Soil SunGrow Horticulture Sunshine Mix #1 Other soil types can also be used to grow Arabidopsis. Mix with water when filling pots.
SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader with LUM Module Molecular Devices Must request a quote Any plate reader capable of detecting luminescence can be used for these assays.
Sucrose Sigma-Aldrich S0389-1KG Store at room temperature.
White Polystyrene 96-Well Plates Fisher Scientific 07-200-589
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Couto, D. E., Zipfel, C. Regulation of pattern recognition receptor signalling in plants. Nature Reviews Immunology. 16, 537-552 (2016).
  2. Boller, T., Felix, G. A Renaissance of Elicitors: Perception of Microbe-Associated Molecular Patterns and Danger Signals by Pattern-Recognition Receptors. Annual Review of Plant Biology. 60, 379-406 (2009).
  3. Marino, D., Dunand, C., Puppo, A., Pauly, N. A burst of plant NADPH oxidases. Trends in Plant Science. 56 (8), 1472-1480 (2012).
  4. Kadota, Y., Shirasu, K., Zipfel, C. Regulation of the NADPH Oxidase RBOHD during Plant Immunity. Plant and Cell Physiology. 56 (8), 1472-1480 (2015).
  5. Yu, X., Feng, B., He, P., Shan, L. From chaos to harmony: responses and signaling upon microbial pattern recognition. Annual Review of Phytopathology. 55, 109-137 (2017).
  6. Doke, N. Involvement of superoxide anion generation in the hypersensitive response of potato tuber tissues to infection with an incompatible race of Phytophthora infestans and to the hyphal wall components. Physiological Plant Pathology. 23 (3), 345-357 (1983).
  7. Bindschedler, L. V., et al. Peroxidase-dependent apoplastic oxidative burst in Arabidopsis required for pathogen resistance. The Plant Journal. 47 (6), 851-863 (2006).
  8. Keppler, L. D. Active Oxygen Production During a Bacteria-Induced Hypersensitive Reaction in Tobacco Suspension Cells. Phytopathology. 110 (3), 759-763 (1989).
  9. Wrzaczek, M., Brosché, M., Kangasjärvi, J. ROS signaling loops – production, perception, regulation. Current Opinion in Plant Biology. 16 (5), 575-582 (2013).
  10. Warm, E., Laties, G. G. Quantification of hydrogen peroxide in plant extracts by the chemiluminescence reaction with luminol. Phytochemistry. 21 (4), 827-831 (1982).
  11. Trujillo, M. Analysis of the lmmunity-Related Oxidative Bursts by a Luminol-Based Assay. Methods in Molecular Biology. 1398, 323-329 (2016).
  12. Nühse, T. S., Bottrill, A. R., Jones, A. M. E., Peck, S. C. Quantitative phosphoproteomic analysis of plasma membrane proteins reveals regulatory mechanisms of plant innate immune responses. The Plant Journal. 51 (5), 931-940 (2007).
  13. Belkhadir, Y., Yang, L., Hetzel, J., Dangl, J. L., Chory, J. The growth-defense pivot: Crisis management in plants mediated by LRR-RK surface receptors. Trends in Biochemical Sciences. 39 (10), 447-456 (2014).
  14. Gómez-Gómez, L., Felix, G., Boller, T. A single locus determines sensitivity to bacterial flagellin in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 18 (3), 277-284 (1999).
  15. Zipfel, C., et al. Perception of the Bacterial PAMP EF-Tu by the Receptor EFR Restricts Agrobacterium-Mediated Transformation. Cell. 125 (4), 749-760 (2006).
  16. Krol, E., et al. Perception of the Arabidopsis danger signal peptide 1 involves the pattern recognition receptor AtPEPR1 and its close homologue AtPEPR2. Journal of Biological Chemistry. 285 (18), 13471-13479 (2010).
  17. Schwessinger, B., et al. Phosphorylation-dependent differential regulation of plant growth, cell death, and innate immunity by the regulatory receptor-like kinase BAK1. PLoS Genetics. 7 (4), e1002046 (2011).
  18. Roux, M., et al. The Arabidopsis Leucine-Rich Repeat Receptor-Like Kinases BAK1/SERK3 and BKK1/SERK4 Are Required for Innate Immunity to Hemibiotrophic and Biotrophic Pathogens. The Plant Cell. 23 (6), 2440-2455 (2011).
  19. Monaghan, J., et al. The calcium-dependent protein kinase CPK28 buffers plant immunity and regulates BIK1 turnover. Cell Host and Microbe. 16 (5), 605-615 (2014).
  20. Wang, J., et al. A Regulatory Module Controlling Homeostasis of a Plant Immune Kinase. Molecular Cell. 69 (3), 493-504 (2018).
  21. Mott, G. A., et al. Genomic screens identify a new phytobacterial microbe-associated molecular pattern and the cognate Arabidopsis receptor-like kinase that mediates its immune elicitation. Genome Biology. 17, 98 (2016).
  22. Sang, Y., Macho, A. P. Analysis of PAMP-Triggered ROS Burst in Plant Immunity. Methods in Molecular Biology. 1578, 143-153 (2017).
  23. Smith, J. M., Heese, A. Rapid bioassay to measure early reactive oxygen species production in Arabidopsis leave tissue in response to living Pseudomonas syringae. Plant Methods. 10 (1), 6 (2014).
  24. Lindsey, B. E., Rivero, L., Calhoun, C. S., Grotewold, E., Brkljacic, J. Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds. Journal of Visualized Experiments. 128, (2017).
  25. Matschi, S., Werner, S., Schulze, W. X., Legen, J., Hilger, H. H., Romeis, T. Function of calcium-dependent protein kinase CPK28 of Arabidopsis thaliana in plant stem elongation and vascular development. The Plant Journal. 73 (6), 883-896 (2013).
  26. Felix, G., Duran, J. D., Volko, S., Boller, T. Plants have a sensitive perception system for the most conserved domain of bacterial flagellin. The Plant Journal. 18 (3), 265-276 (2002).
  27. Kunze, G., Zipfel, C., Robatzek, S., Niehaus, K., Boller, T., Felix, G. The N Terminus of Bacterial Elongation Factor Tu Elicits Innate Immunity in Arabidopsis Plants. The Plant Cell. 16 (12), 3496-3507 (2004).
  28. Zipfel, C., et al. Bacterial disease resistance in Arabidopsis through flagellin perception. Nature. 428 (6984), 764-767 (2004).
  29. Mur, L. A. J., Kenton, P., Draper, J. In planta measurements of oxidative bursts elicited by avirulent and virulent bacterial pathogens suggests that H2O2 is insufficient to elicit cell death in tobacco. Plant, Cell and Environment. 28 (4), 548-561 (2005).
  30. Kobayashi, M., et al. Calcium-dependent protein kinases regulate the production of reactive oxygen species by potato NADPH oxidase. The Plant Cell. 19 (3), 1065-1080 (2007).
  31. Yoshioka, H., et al. Induction of Plant gp91 phox Homolog by Fungal Cell Wall, Arachidonic Acid, and Salicylic Acid in Potato. Molecular Plant-Microbe Interactions. 14 (6), 725-736 (2001).
  32. Klauser, D., Flury, P., Boller, T., Bartels, S. Several MAMPs, including chitin fragments, enhance AtPep-triggered oxidative burst independently of wounding. Plant Signaling and Behavior. 8 (9), e25346 (2013).
  33. El Gueddari, N. E., Rauchhaus, U., Moerschbacher, B. M., Deising, H. B. Developmentally regulated conversion of surface-exposed chitin to chitosan in cell walls of plant pathogenic fungi. New Phytologist. 156 (1), 103-112 (2002).
  34. Daiber, A., et al. Detection of superoxide and peroxynitrite in model systems and mitochondria by the luminol analogue L-012. Free Radical Research. 38 (3), 259-269 (2004).
  35. Bauer, Z., Gómez-Gómez, L., Boller, T., Felix, G. Sensitivity of Different Ecotypes and Mutants of Arabidopsis thaliana toward the Bacterial Elicitor Flagellin Correlates with the Presence of Receptor-binding Sites. Journal of Biological Chemistry. 276 (49), 45669-45676 (2001).
  36. Vetter, M. M., et al. Flagellin perception varies quantitatively in arabidopsis thaliana and its relatives. Molecular Biology and Evolution. 29 (6), 1655-1667 (2012).
  37. Chinchilla, D. The Arabidopsis Receptor Kinase FLS2 Binds flg22 and Determines the Specificity of Flagellin Perception. The Plant Cell. 18 (2), 465-476 (2006).
  38. Lloyd, S. R., Schoonbeek, H., Trick, M., Zipfel, C., Ridout, C. J. Methods to Study PAMP-Triggered Immunity in Brassica Species. Molecular Plant-Microbe Interactions. 27 (3), 286-295 (2014).
  39. Clarke, C., Vinatzer, B. Characterizing the Immune-Eliciting Activity of Putative Microbe-Associated Molecular Patterns in Tomato. Methods in Molecular Biology. 1578, 249-261 (2017).
  40. Gimenez-Ibanez, S., Hann, D. R., Chang, J. H., Segonzac, C., Boller, T., Rathjen, J. P. Differential Suppression of Nicotiana benthamiana Innate Immune Responses by Transiently Expressed Pseudomonas syringae Type III Effectors. Frontiers in Plant Science. 9, 688 (2018).
  41. Wei, Y., et al. The Ralstonia solanacearum csp22 peptide, but not flagellin-derived peptides, is perceived by plants from the Solanaceae family. Plant Biotechnology Journal. 16 (7), 1349-1362 (2018).
  42. Melcher, R. L. J., Moerschbacher, B. M. An improved microtiter plate assay to monitor the oxidative burst in monocot and dicot plant cell suspension cultures. Plant Methods. 12, 5 (2016).
  43. Perraki, A., et al. Phosphocode-dependent functional dichotomy of a common co-receptor in plant signalling. Nature. 561 (7722), 248-252 (2018).
  44. Yamaguchi, K., Kawasaki, T. Chitin-Triggered MAPK Activation and ROS Generation in Rice Suspension-Cultured Cells. Methods in Molecular Biology. 1578, 309-316 (2017).
  45. Ortmann, I., Conrath, U., Moerschbacher, B. M. Exopolysaccharides of Pantoea agglomerans have different priming and eliciting activities in suspension-cultured cells of monocots and dicots. FEBS Letters. 580 (18), 4491-4494 (2006).
  46. Ortmann, I., Sumowski, G., Bauknecht, H., Moerschbacher, B. M. Establishment of a reliable protocol for the quantification of an oxidative burst in suspension-cultured wheat cells upon elicitation. Physiological and Molecular Plant Pathology. 64 (5), 227-232 (2004).
  47. Dos Santos, A. L. W., El Gueddari, N. E., Trombotto, S., Moerschbacher, B. M. Partially acetylated chitosan oligo- and polymers induce an oxidative burst in suspension cultured cells of the gymnosperm Araucaria angustifolia. Biomacromolecules. 9 (12), 3411-3415 (2008).
  48. Bressendorff, S., Rasmussen, M., Petersen, M., Mundy, J. Chitin-Induced Responses in the Moss Physcomitrella patens. Methods in Molecular Biology. , 317-324 (2017).
  49. Lloyd, S. R., Ridout, C. J., Schoonbeek, H. Methods to Quantify PAMP-Triggered Oxidative Burst, MAP Kinase Phosphorylation, Gene Expression, and Lignification in Brassicas. Methods in Molecular Biology. 1578, 325-335 (2017).
  50. Gómez-Gómez, L., Boller, T. FLS2: An LRR Receptor-like Kinase involved in the perception of the bacterial elicitor flagellin in Arabidopsis. Molecular Cell. 5 (6), 1003-1011 (2000).
  51. Li, J., et al. Specific ER quality control components required for biogenesis of the plant innate immune receptor EFR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15973-15978 (2009).
  52. Lu, X., et al. Uncoupling of sustained MAMP receptor signaling from early outputs in an Arabidopsis endoplasmic reticulum glucosidase II allele. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (52), 22522-22527 (2009).
  53. Nekrasov, V., et al. Control of the pattern-recognition receptor EFR by an ER protein complex in plant immunity. EMBO Journal. 28 (21), 3428-3438 (2009).
  54. Boutrot, F., et al. Direct transcriptional control of the Arabidopsis immune receptor FLS2 by the ethylene-dependent transcription factors EIN3 and EIL1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (32), 14502-14507 (2010).
  55. Kadota, Y., et al. Direct Regulation of the NADPH Oxidase RBOHD by the PRR-Associated Kinase BIK1 during Plant Immunity. Molecular Cell. 54 (1), 43-55 (2014).

Tags

Keywords: Arabidopsis ThalianaPattern-triggeredOxidative BurstSeedling Growth InhibitionImmune OutputsPlant GenotypesLaboratory EquipmentLeaf DiscsElicitorsReactive Oxygen SpeciesMicroplate ReaderMS MediumSeedling GrowthGrowth Inhibition
check_url/pt/59437?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Bredow, M., Sementchoukova, I., Siegel, K., Monaghan, J. Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (147), e59437, doi:10.3791/59437 (2019).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image