JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Imunologia e Infecção

Arabidopsis thaliana 'Da desen tetiklenen oksidatif patlama ve fide büyüme Inhibisyonu asder

Published: May 21, 2019
doi:
10.3791/59437
, , ,
1Department of Biology,Queen’s University

Summary

Bu yazıda bağışıklık elicitors maruz aşağıdaki Arabidopsis thaliana savunma tepkiler miktarının için iki yöntem açıklanmaktadır: geçici oksidatif patlama ve fide büyüme inhibisyonu.

Abstract

Bitkiler, patojenleri algılamak ve hastalığa karşı korumak için sağlam bir bağışıklık sistemi geliştirmiştir. Bu yazıda elicitor molekülleri ile tedavi sonrasında Arabidopsis thaliana bağışıklık aktivasyonunun gücünü ölçmek için kullanılabilecek iki asder açıklanmaktadır. İlk sunulan bir luminol tabanlı tahlil kullanılarak izlenebilir hızla indüklenen ve dinamik oksidatif patlama, yakalamak için bir yöntemdir. İkinci sundu fide büyüme bağışıklık kaynaklı inhibisyonu ölçmek için nasıl açıklayan bir yöntemdir. Bu protokoller hızlı ve güvenilirdir, özel eğitim veya ekipman gerektirmez ve bitki dokunulmazlığının genetik temelini anlamak için yaygın olarak kullanılır.

Introduction

Patojenlere karşı tespit etmek ve savunmak için, bitkiler mikroorganizma ilişkili moleküler desenler (MAMPs)1olarak bilinen hücrenin dışında bulunan mikrobiyal molekülleri algılayan membran bağlı desen tanıma reseptörleri (prrs) gelişti. MAMPs ‘ın bilat PRRs ‘larına bağlanması, geniş spektrumlu hastalık direnci2‘ ye neden olan protein kinaz aracılı bağışıklık sinyallerini başlatır. PRR aktivasyonunun ardından en erken yanıtlardan biri, ekstraselüler reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretimini katalizleştiren entegre plazma membranı solunum PATLAMASı OKSIDAZ HOMOLOG (RBOH) proteinlerinin fosforilasyon ve aktivasyonu olduğunu3 , 4. Ros bağışıklık sinyalizasyon yanı sıra doğrudan antimikrobiyal ajanlar5yaymak için ikincil haberciler olarak hareket, hastalık direnci kurulması önemli bir rol oynamaktadır. Bağışıklık-elicited oksidatif patlama ilk gözlem CV patates yumrular kullanılarak tanımlanmıştır. Rishiri Phytophthora Mildiyö aşı takip6. ROS üretimi, yaprak diskler7, hücre süspansiyon kültürleri8ve protoplastlar6kullanarak çeşitli bitki türlerinde değerlendirildi. Burada açıklanan Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) yaprak DISKLER desen tetiklenen Ros üretimi için basit bir yöntemdir.

Mamp algı bir yanıt olarak, aktif rboh proteinleri superoksit radikallerin üretimini katalizler (o2–), hidroksil radikaller (• Oh), ve atlet oksijen (1o2) hidrojen peroksit dönüştürülür (H2o 2) ekstrellüler uzayda9. H2O2 oksitleyici ajanın varlığında luminol tabanlı kemiluminesans ile NICELIK olabilir (HRP)10. HRP oksitler H2O2 üreten bir HIDROKSIT iyon (Oh−) ve oksijen gazı (O2) hangi ışık bir foton bültenleri kararsız bir ara üretmek için luminol ile reaksiyon10. Foton emisyonu bağıl ışık üniteleri (RLUs) olarak, en moleküler laboratuvarlarda standart ekipman parçaları haline gelen Luminesans algılayabilen bir Mikroplaka Okuyucu veya görüntü kullanarak nicelik olabilir. 40-60 dakikalık bir Aralık üzerinde üretilen ışığı ölçerek, geçici bir oksidatif patlama, elicitor tedavisinden sonra 2-5 dakika kadar erken, 10-20 dakika içinde peaking ve ~ 60 dakika11‘ den sonra bazal seviyelere dönerek tespit edilebilir. Bu zaman kursunda üretilen birikimli ışık, RBOH proteinlerinin aktivasyonuna karşılık gelen bağışıklık gücünün bir ölçüsü olarak kullanılabilir12. Uygun, bu tahlil özel ekipman veya hantal numune hazırlama gerektirmez.

MAMP algılama kısa bir süre sonra peaking, oksidatif patlama erken bağışıklık yanıtı olarak kabul edilir, MAPK aktivasyon ve etilen üretimi ile birlikte5. Daha sonra bağışıklık tepkiler transkripsiyonel yeniden programlama, evcikli kapatma ve kallose biriktirme2,5içerir. MAMPs ‘a uzun süreli maruz kalma, bitki büyümesinin inhibisyonu ile sonuçlanan, kalkınma ve bağışıklık13arasında bir ticaret-off göstergesidir. Desen-tetiklenen fide büyüme inhibisyonu (SGI) yaygın Arabidopsis bağışıklık çıkışı değerlendirmek için kullanılan ve prrs dahil bağışıklık sinyalizasyon birkaç anahtar bileşenlerinin tanımlanması için ayrılmaz olmuştur14,15 ,16. Bu nedenle, bu kağıt Ayrıca model için bir tahlil sunuyor- Arabidopsisiçinde SGI tetikleyen, fidanlar çok iyi plakalar standart medya veya medya 8-12 gün için bir bağışıklık elicitor ile tamamlayıcı içeren yetiştirilen ve daha sonra tartılır analitik bir ölçek kullanarak.

ROS ve SGı ‘nin PRR-aracılı sinyalizasyon izlemek için nasıl kullanıldığını göstermek için, farklı bağışıklık çıkışlarını temsil eden üç genotip seçilmiştir: (1) vahşi tip Arabidopsis üyeliği Columbia (col-0), (2) dominant-negatif BaK1-5 mutant içinde çok fonksiyonlu PRR Co-reseptör brassinosteroıd duyarsız 1-ilişkili kinase 1 (BAK1) bağışıklık sinyalizasyon fonksiyonel olmayan17,18, ve (3) resessive cpk28-1 mutant, hangi yoksun Düzenleyici protein kalsiyum bağımlı protein kinaz 28 (CPK28) ve görüntüler artmış bağışıklık tetiklenen tepkiler19,20. Ros ve SGI tanılar, PRR EF-tu reseptör (EFR)15ile Arabidopsis ‘te tanınan, bakteri uzaması Factor tu (EF-tu) ‘ ın sentetik olarak üretilen elf18 peptid epitopu yanıtı ile sunulmuştur. Bu protokoller bakteriyel motilite protein flagellin14 veya endojen bitki Elicitor proteinleri (AtPeps)16gibi diğer immün elicitors ile kullanılabilir, ancak, bu bitki yanıt bağlı olarak farklılık unutulmamalıdır 21. ROS ve SGı desteği, erken ve geç PRR aracılı yanıtların hızlı ve nicel değerlendirilmesi için kullanılabilir.

Protocol

1. bağışıklık özelliğini takiben Arabidopsis yaprak DISKLERINDE Ros patlaması algılanması Bitki büyüme ve bakım. Çimlenme senkronize etmek için, yaklaşık 50 tohumları askıya alarak Arabidopsis tohumları tabakalaşmak steril 0,1% agar [w/v] ve mağaza 4 °c (ışık yok) içinde 3-4 gün için 1 ml.Not: bir vahşi tür arka plan denetimi (örneğin, col-0) ve yüksek ve düşük bağışıklık çıkışları (örneğin, cpk28-1 ve BaK1-5, sıra…

Representative Results

Mutant cpk28-119,25 ve BaK1-517,18 bitkiler oksidatif patlama ve sgi, sırasıyla, yüksek ve düşük immün tepkiler ile genotipler için beklenen sonuçları göstermek için kullanıldı bir vahşi tür arka plan denetimi (col-0) göreli olarak diyor. Doz bağımlı etkileri değerlendirmek için, 10 kat peptid seyreltme serisi (1-1000 nM) elf18 kulla…

Discussion

Bu yazıda, Arabidopsis‘te desen tetiklenen immün tepkiler vermek için iki yöntem açıklanmaktadır, özel ekipman kullanmadan bağışıklık çıkışını değerlendirmek için nicel yaklaşımlar sunar. Kombinasyon halinde, çoğaltma tetikleyen ROS ve SGı, sırasıyla mikrobe algısına erken ve geç yanıt değerlendirmek için kullanılabilir.

Oksidatif patlama tahlil büyük sınırlama değişkenlik olduğunu. Tamamen anlaşılmayan nedenlerle, mutlak RLUs ‘Lar genellikl…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Laboratuvarımızda çalışmak, Kanada ‘nın doğal kaynaklar ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) Discovery programı, Kanadalı Inovasyon Vakfı John R. Evans Leader ‘ın Fonu ve Kraliçe ‘nin Üniversitesi aracılığıyla finanse edilmektedir. KS ve yüksek lisans öğrencileri (CGS-M) için tandem Ontario Lisansüstü Bursları ve NSERC Kanada lisansüstü Burslar tarafından desteklenir.

Materials

20-20-20 Fertilizer Plant Prod 10529 Mix 1g/L in water and apply to plants every 2 weeks for optimal growth.
4 mm Biopsy Punch Medical Mart 232-33-34-P A cork borer set with a 0.125 cm^2 surface area can also be used.
48-Well Sterile Plates with Lid Sigma-Aldrich CLS3548
Analytical Scale with Draft Sheid VWR VWR-225AC Any standard analytical scale can be used for growth inibition assays, however, a direct computer output is optimal.
BioHit mLine Mechanical 12 Multichannel Pipette (30-300 uL) Sartorius 725240 Any multichannel pipette can be used, as can a single pipetter if necessary.
elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG) EZ Biolab cp7211 Store 10 mM stock peptide at -80C in low protein binding tubes. When thawed, store 100 uM working stock at -20C.
Forceps Fisher Scientific 22-327379
Horseradish Peroxidase Sigma-Aldrich P6782 Dissolve in pure water. Store at -20C and away from light.
Luminol Sigma-Aldrich A8511 Dissolve in DMSO. Store at -20C and away from light.
Murisage and Skoog Basal Salts Cedarlane Labs MSP09-100LT Store at 4C.
Soil SunGrow Horticulture Sunshine Mix #1 Other soil types can also be used to grow Arabidopsis. Mix with water when filling pots.
SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader with LUM Module Molecular Devices Must request a quote Any plate reader capable of detecting luminescence can be used for these assays.
Sucrose Sigma-Aldrich S0389-1KG Store at room temperature.
White Polystyrene 96-Well Plates Fisher Scientific 07-200-589
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Couto, D. E., Zipfel, C. Regulation of pattern recognition receptor signalling in plants. Nature Reviews Immunology. 16, 537-552 (2016).
  2. Boller, T., Felix, G. A Renaissance of Elicitors: Perception of Microbe-Associated Molecular Patterns and Danger Signals by Pattern-Recognition Receptors. Annual Review of Plant Biology. 60, 379-406 (2009).
  3. Marino, D., Dunand, C., Puppo, A., Pauly, N. A burst of plant NADPH oxidases. Trends in Plant Science. 56 (8), 1472-1480 (2012).
  4. Kadota, Y., Shirasu, K., Zipfel, C. Regulation of the NADPH Oxidase RBOHD during Plant Immunity. Plant and Cell Physiology. 56 (8), 1472-1480 (2015).
  5. Yu, X., Feng, B., He, P., Shan, L. From chaos to harmony: responses and signaling upon microbial pattern recognition. Annual Review of Phytopathology. 55, 109-137 (2017).
  6. Doke, N. Involvement of superoxide anion generation in the hypersensitive response of potato tuber tissues to infection with an incompatible race of Phytophthora infestans and to the hyphal wall components. Physiological Plant Pathology. 23 (3), 345-357 (1983).
  7. Bindschedler, L. V., et al. Peroxidase-dependent apoplastic oxidative burst in Arabidopsis required for pathogen resistance. The Plant Journal. 47 (6), 851-863 (2006).
  8. Keppler, L. D. Active Oxygen Production During a Bacteria-Induced Hypersensitive Reaction in Tobacco Suspension Cells. Phytopathology. 110 (3), 759-763 (1989).
  9. Wrzaczek, M., Brosché, M., Kangasjärvi, J. ROS signaling loops – production, perception, regulation. Current Opinion in Plant Biology. 16 (5), 575-582 (2013).
  10. Warm, E., Laties, G. G. Quantification of hydrogen peroxide in plant extracts by the chemiluminescence reaction with luminol. Phytochemistry. 21 (4), 827-831 (1982).
  11. Trujillo, M. Analysis of the lmmunity-Related Oxidative Bursts by a Luminol-Based Assay. Methods in Molecular Biology. 1398, 323-329 (2016).
  12. Nühse, T. S., Bottrill, A. R., Jones, A. M. E., Peck, S. C. Quantitative phosphoproteomic analysis of plasma membrane proteins reveals regulatory mechanisms of plant innate immune responses. The Plant Journal. 51 (5), 931-940 (2007).
  13. Belkhadir, Y., Yang, L., Hetzel, J., Dangl, J. L., Chory, J. The growth-defense pivot: Crisis management in plants mediated by LRR-RK surface receptors. Trends in Biochemical Sciences. 39 (10), 447-456 (2014).
  14. Gómez-Gómez, L., Felix, G., Boller, T. A single locus determines sensitivity to bacterial flagellin in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 18 (3), 277-284 (1999).
  15. Zipfel, C., et al. Perception of the Bacterial PAMP EF-Tu by the Receptor EFR Restricts Agrobacterium-Mediated Transformation. Cell. 125 (4), 749-760 (2006).
  16. Krol, E., et al. Perception of the Arabidopsis danger signal peptide 1 involves the pattern recognition receptor AtPEPR1 and its close homologue AtPEPR2. Journal of Biological Chemistry. 285 (18), 13471-13479 (2010).
  17. Schwessinger, B., et al. Phosphorylation-dependent differential regulation of plant growth, cell death, and innate immunity by the regulatory receptor-like kinase BAK1. PLoS Genetics. 7 (4), e1002046 (2011).
  18. Roux, M., et al. The Arabidopsis Leucine-Rich Repeat Receptor-Like Kinases BAK1/SERK3 and BKK1/SERK4 Are Required for Innate Immunity to Hemibiotrophic and Biotrophic Pathogens. The Plant Cell. 23 (6), 2440-2455 (2011).
  19. Monaghan, J., et al. The calcium-dependent protein kinase CPK28 buffers plant immunity and regulates BIK1 turnover. Cell Host and Microbe. 16 (5), 605-615 (2014).
  20. Wang, J., et al. A Regulatory Module Controlling Homeostasis of a Plant Immune Kinase. Molecular Cell. 69 (3), 493-504 (2018).
  21. Mott, G. A., et al. Genomic screens identify a new phytobacterial microbe-associated molecular pattern and the cognate Arabidopsis receptor-like kinase that mediates its immune elicitation. Genome Biology. 17, 98 (2016).
  22. Sang, Y., Macho, A. P. Analysis of PAMP-Triggered ROS Burst in Plant Immunity. Methods in Molecular Biology. 1578, 143-153 (2017).
  23. Smith, J. M., Heese, A. Rapid bioassay to measure early reactive oxygen species production in Arabidopsis leave tissue in response to living Pseudomonas syringae. Plant Methods. 10 (1), 6 (2014).
  24. Lindsey, B. E., Rivero, L., Calhoun, C. S., Grotewold, E., Brkljacic, J. Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds. Journal of Visualized Experiments. 128, (2017).
  25. Matschi, S., Werner, S., Schulze, W. X., Legen, J., Hilger, H. H., Romeis, T. Function of calcium-dependent protein kinase CPK28 of Arabidopsis thaliana in plant stem elongation and vascular development. The Plant Journal. 73 (6), 883-896 (2013).
  26. Felix, G., Duran, J. D., Volko, S., Boller, T. Plants have a sensitive perception system for the most conserved domain of bacterial flagellin. The Plant Journal. 18 (3), 265-276 (2002).
  27. Kunze, G., Zipfel, C., Robatzek, S., Niehaus, K., Boller, T., Felix, G. The N Terminus of Bacterial Elongation Factor Tu Elicits Innate Immunity in Arabidopsis Plants. The Plant Cell. 16 (12), 3496-3507 (2004).
  28. Zipfel, C., et al. Bacterial disease resistance in Arabidopsis through flagellin perception. Nature. 428 (6984), 764-767 (2004).
  29. Mur, L. A. J., Kenton, P., Draper, J. In planta measurements of oxidative bursts elicited by avirulent and virulent bacterial pathogens suggests that H2O2 is insufficient to elicit cell death in tobacco. Plant, Cell and Environment. 28 (4), 548-561 (2005).
  30. Kobayashi, M., et al. Calcium-dependent protein kinases regulate the production of reactive oxygen species by potato NADPH oxidase. The Plant Cell. 19 (3), 1065-1080 (2007).
  31. Yoshioka, H., et al. Induction of Plant gp91 phox Homolog by Fungal Cell Wall, Arachidonic Acid, and Salicylic Acid in Potato. Molecular Plant-Microbe Interactions. 14 (6), 725-736 (2001).
  32. Klauser, D., Flury, P., Boller, T., Bartels, S. Several MAMPs, including chitin fragments, enhance AtPep-triggered oxidative burst independently of wounding. Plant Signaling and Behavior. 8 (9), e25346 (2013).
  33. El Gueddari, N. E., Rauchhaus, U., Moerschbacher, B. M., Deising, H. B. Developmentally regulated conversion of surface-exposed chitin to chitosan in cell walls of plant pathogenic fungi. New Phytologist. 156 (1), 103-112 (2002).
  34. Daiber, A., et al. Detection of superoxide and peroxynitrite in model systems and mitochondria by the luminol analogue L-012. Free Radical Research. 38 (3), 259-269 (2004).
  35. Bauer, Z., Gómez-Gómez, L., Boller, T., Felix, G. Sensitivity of Different Ecotypes and Mutants of Arabidopsis thaliana toward the Bacterial Elicitor Flagellin Correlates with the Presence of Receptor-binding Sites. Journal of Biological Chemistry. 276 (49), 45669-45676 (2001).
  36. Vetter, M. M., et al. Flagellin perception varies quantitatively in arabidopsis thaliana and its relatives. Molecular Biology and Evolution. 29 (6), 1655-1667 (2012).
  37. Chinchilla, D. The Arabidopsis Receptor Kinase FLS2 Binds flg22 and Determines the Specificity of Flagellin Perception. The Plant Cell. 18 (2), 465-476 (2006).
  38. Lloyd, S. R., Schoonbeek, H., Trick, M., Zipfel, C., Ridout, C. J. Methods to Study PAMP-Triggered Immunity in Brassica Species. Molecular Plant-Microbe Interactions. 27 (3), 286-295 (2014).
  39. Clarke, C., Vinatzer, B. Characterizing the Immune-Eliciting Activity of Putative Microbe-Associated Molecular Patterns in Tomato. Methods in Molecular Biology. 1578, 249-261 (2017).
  40. Gimenez-Ibanez, S., Hann, D. R., Chang, J. H., Segonzac, C., Boller, T., Rathjen, J. P. Differential Suppression of Nicotiana benthamiana Innate Immune Responses by Transiently Expressed Pseudomonas syringae Type III Effectors. Frontiers in Plant Science. 9, 688 (2018).
  41. Wei, Y., et al. The Ralstonia solanacearum csp22 peptide, but not flagellin-derived peptides, is perceived by plants from the Solanaceae family. Plant Biotechnology Journal. 16 (7), 1349-1362 (2018).
  42. Melcher, R. L. J., Moerschbacher, B. M. An improved microtiter plate assay to monitor the oxidative burst in monocot and dicot plant cell suspension cultures. Plant Methods. 12, 5 (2016).
  43. Perraki, A., et al. Phosphocode-dependent functional dichotomy of a common co-receptor in plant signalling. Nature. 561 (7722), 248-252 (2018).
  44. Yamaguchi, K., Kawasaki, T. Chitin-Triggered MAPK Activation and ROS Generation in Rice Suspension-Cultured Cells. Methods in Molecular Biology. 1578, 309-316 (2017).
  45. Ortmann, I., Conrath, U., Moerschbacher, B. M. Exopolysaccharides of Pantoea agglomerans have different priming and eliciting activities in suspension-cultured cells of monocots and dicots. FEBS Letters. 580 (18), 4491-4494 (2006).
  46. Ortmann, I., Sumowski, G., Bauknecht, H., Moerschbacher, B. M. Establishment of a reliable protocol for the quantification of an oxidative burst in suspension-cultured wheat cells upon elicitation. Physiological and Molecular Plant Pathology. 64 (5), 227-232 (2004).
  47. Dos Santos, A. L. W., El Gueddari, N. E., Trombotto, S., Moerschbacher, B. M. Partially acetylated chitosan oligo- and polymers induce an oxidative burst in suspension cultured cells of the gymnosperm Araucaria angustifolia. Biomacromolecules. 9 (12), 3411-3415 (2008).
  48. Bressendorff, S., Rasmussen, M., Petersen, M., Mundy, J. Chitin-Induced Responses in the Moss Physcomitrella patens. Methods in Molecular Biology. , 317-324 (2017).
  49. Lloyd, S. R., Ridout, C. J., Schoonbeek, H. Methods to Quantify PAMP-Triggered Oxidative Burst, MAP Kinase Phosphorylation, Gene Expression, and Lignification in Brassicas. Methods in Molecular Biology. 1578, 325-335 (2017).
  50. Gómez-Gómez, L., Boller, T. FLS2: An LRR Receptor-like Kinase involved in the perception of the bacterial elicitor flagellin in Arabidopsis. Molecular Cell. 5 (6), 1003-1011 (2000).
  51. Li, J., et al. Specific ER quality control components required for biogenesis of the plant innate immune receptor EFR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15973-15978 (2009).
  52. Lu, X., et al. Uncoupling of sustained MAMP receptor signaling from early outputs in an Arabidopsis endoplasmic reticulum glucosidase II allele. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (52), 22522-22527 (2009).
  53. Nekrasov, V., et al. Control of the pattern-recognition receptor EFR by an ER protein complex in plant immunity. EMBO Journal. 28 (21), 3428-3438 (2009).
  54. Boutrot, F., et al. Direct transcriptional control of the Arabidopsis immune receptor FLS2 by the ethylene-dependent transcription factors EIN3 and EIL1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (32), 14502-14507 (2010).
  55. Kadota, Y., et al. Direct Regulation of the NADPH Oxidase RBOHD by the PRR-Associated Kinase BIK1 during Plant Immunity. Molecular Cell. 54 (1), 43-55 (2014).

Tags

Keywords: Arabidopsis ThalianaPattern-triggeredOxidative BurstSeedling Growth InhibitionImmune OutputsPlant GenotypesLaboratory EquipmentLeaf DiscsElicitorsReactive Oxygen SpeciesMicroplate ReaderMS MediumSeedling GrowthGrowth Inhibition
check_url/pt/59437?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Bredow, M., Sementchoukova, I., Siegel, K., Monaghan, J. Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (147), e59437, doi:10.3791/59437 (2019).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image