Robusto confronto dei livelli della proteina attraverso tessuti e sviluppo utilizzando standardizzati quantitativa Western Blotting
Summary
Questo metodo viene descritto un approccio affidabile e riproducibile per il confronto dei livelli della proteina in tessuti differenti e timepoints inerente allo sviluppo diversi utilizzando un approccio macchiante occidentale quantitativo standardizzato.
Abstract
Macchiarsi occidentale è una tecnica comunemente utilizzata per rilevare e quantificare l’espressione della proteina. Nel corso degli anni, questa tecnica ha portato a molti progressi nella ricerca clinica e di base. Tuttavia, come con molte tecniche sperimentali simili, l’esito delle analisi Western blot è facilmente influenzato dalla scelte operate nella progettazione e nell’esecuzione dell’esperimento. Proteine specifiche delle pulizie sono stati tradizionalmente usati per normalizzare i livelli di proteina per la quantificazione, tuttavia, questi hanno una serie di limitazioni e di conseguenza sono stati criticati sempre più negli ultimi anni. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato che abbiamo sviluppato ci permettono di intraprendere confronti complessi della variazione di espressione di proteine in tessuti differenti, modelli murini (inclusi modelli di malattia) e punti temporali inerente allo sviluppo. Usando una macchia fluorescente della proteina totale e introducendo l’uso di un carico interno standard, è possibile superare le attuali limitazioni del numero di campioni che possono essere paragonati all’interno di esperimenti e confrontare sistematicamente i livelli della proteina attraverso un gamma di condizioni sperimentali. Questo approccio consente di espandere l’uso di tecniche tradizionali occidentali della macchia, consentendo ai ricercatori di esplorare meglio l’espressione della proteina attraverso campioni e tessuti differenti.
Introduction
Macchiarsi occidentale è una tecnica comunemente utilizzata per rilevare e quantificare l’espressione della proteina, compreso in omogenati o estratti. Nel corso degli anni, questa tecnica ha portato a molti progressi nella ricerca clinica e di base, dove può essere utilizzato come strumento diagnostico per identificare la presenza di malattia1,2. Macchiarsi occidentale in primo luogo è stato descritto nel 1979 come un metodo per trasferire proteine dal gel di poliacrilammide ai fogli di nitrocellulosa e successivamente visualizzare proteine usando anticorpi secondari che sono stati etichettati radioattivo o coniugati con fluoresceina o perossidasi3. Attraverso lo sviluppo di kit commercialmente disponibili e attrezzature, metodi macchiantesi occidentali sono stati sempre più standardizzati e semplificati nel corso degli anni. Infatti, la tecnica viene eseguita prontamente dagli scienziati con diversi sfondi e livelli di esperienza. Tuttavia, come con molte tecniche sperimentali simili, l’esito delle analisi Western blot è facilmente influenzato dalla scelte operate nella progettazione e nell’esecuzione dell’esperimento. È importante, pertanto, che l’accessibilità dei metodi standardizzati di macchiantesi occidentali non oscurare la necessità di un’attenta pianificazione sperimentale e il design. Considerazioni sperimentali includono, ma non sono limitata a, campione di preparazione e movimentazione, selezione e convalida degli anticorpi per la rilevazione di proteine ed efficienza del trasferimento di gel alla membrana di particolarmente piccole o grandi ( 140 kDa) proteine4,5,6,7,8,9. Qualità delle proteine del campione originale svolge un ruolo significativo nel determinare l’esito dell’analisi Western blot successivi. Come la proteina può essere estratta da una vasta gamma di campioni e fonti, tra cui linee cellulari, tessuti dai modelli animali e tessuti umani post mortem, coerenza nel trattamento e l’elaborazione è necessaria per ottenere risultati riproducibili. Ad esempio, quando a lungo termine conservazione dei campioni per l’estrazione proteica è necessaria, è importante rendersi conto che, anche se la proteina è generalmente stabile a-80 ° C, sono state differenze nella stabilità proteica proteine estratte e tessuti intatti a-80 ° C riferito10. Inoltre, per ottenere preventivi riproducibile di quantità di proteina, coerente omogeneizzazione dei campioni è fondamentale. Ottimizzazione del buffer di lisi diverse e metodi di omogeneizzazione (ad es., manuale omogeneizzazione rispetto ai metodi automatizzati) può essere richiesto prima di iniziare un esperimento su larga scala quantitativo.
Strategie di normalizzazione per correggere la variabilità di caricamento e quantificazione di proteine sono essenziali per ottenere risultati quantitativi, robusti dell’espressione della proteina. Servizio pulizie proteine come β-actina, α-tubulina e β-tubulina gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH) sono stati tradizionalmente utilizzati per normalizzare i livelli di proteina per la quantificazione. Tuttavia, normalizzazione alle proteine di pulizia specifico per scopi di quantificazione è stato sempre più criticato negli ultimi pochi anni11,12. Ad esempio, l’espressione di proteine le pulizie può cambiare nei diversi stadi di sviluppo13,14, attraverso i tessuti da stesso animale4e sotto varie malattia condizioni4,15 ,16,17. Pertanto, l’uso di proteine specifiche delle pulizie limita le possibilità di fare confronti più complessi tra l’espressione della proteina dai tessuti differenti, timepoints diversi e in diverse condizioni sperimentali. Un’alternativa alle proteine di pulizia al controllo per proteina variazione di carico è l’uso di una macchia di proteine totali (TPS) che le etichette e Visualizza tutte le proteine presenti in un campione. TPS permette la normalizzazione del segnale basato su carico proteico totale, piuttosto che i livelli di una proteina specifica e pertanto la quantificazione del segnale TPS dovrebbero essere comparabili e riproducibile indipendentemente dalla condizione sperimentale, tipo di campione o timepoint inerente allo sviluppo . Sono esempi di proteine totali macchie Ponceau S, gel senza macchia, Coomassie R-350, Sypro Ruby, Epicocconone, Amydo Black e Cy5 (rivisto in rif. 18). Ciascuno di questi metodi presenta specifici vantaggi e limitazioni e selezione del metodo dipende il tempo e gli strumenti disponibili, nonché la messa a punto sperimentale4,18.
Oltre a utilizzare un TPS per correggere per il carico all’interno della membrana e variabilità di quantificazione, può essere necessario confrontare campioni tra diverse membrane, in particolare quando si eseguono analisi di espressione di proteine su larga scala. Tuttavia, variabilità in fattori come anticorpo associazione efficienza e totale intensità di colorazione di proteina possono introdurre ulteriori variabilità tra i campioni della proteina che sono analizzati su gel separati e membrane. Per quantificazione solida in questa situazione, è pertanto necessario introdurre un ulteriore passo di normalizzazione per rappresentare la variabilità tra membrana. Ciò può essere ottenuto includendo uno standard interno carico su ciascuna delle membrane separatamente analizzate che viene mantenuta costante attraverso esperimenti. Questo standard può assumere la forma di qualsiasi proteina lisata che possono essere ottenuti in quantità sufficienti per essere utilizzati in tutte le membrane incluse nell’esperimento. Qui, usiamo un lisato di cervello di topo (ottenuto da topi di controllo 5 giorno vecchio), come cervello prontamente è omogeneizzato e il lisato proteico ottenuta contiene una notevole quantità di proteina ad un’alta concentrazione. Caricamento di uno standard interno in triplice copia permette campioni su membrane separate essere normalizzato e confrontato direttamente.
Qui, descriviamo un protocollo dettagliato che abbiamo sviluppato ci permettono di intraprendere confronti complessi della variazione di espressione di proteine in tessuti differenti, modelli murini (inclusi modelli di malattia) e punti temporali dello sviluppo19. Combinando un TPS fluorescente con l’utilizzo di un carico interno standard, siamo stati in grado di superare i limiti esistenti il numero di campioni e condizioni sperimentali che possono essere paragonate all’interno di un singolo esperimento. Questo approccio consente di espandere l’uso di tecniche tradizionali Western blot, consentendo ai ricercatori di esplorare meglio l’espressione della proteina attraverso campioni e tessuti differenti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Con il disegno sperimentale appropriato, misure di controllo e analisi statistica, macchiarsi occidentale può essere utilizzato per rendere affidabili stime quantitative dell’espressione della proteina all’interno e tra una vasta gamma di campioni biologici. Il protocollo che descriviamo nel manoscritto attuale mira a servire come una guida per i ricercatori cercano di utilizzare Western blotting per intraprendere analisi quantitativa tra i più grandi e complessi gruppi di campioni, utilizzando una combinazione di fluo…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
E.J.N.G. è supportato dal Wellcome Trust (grant 106098/Z/14/Z). Altri finanziamenti è stato fornito dal Trust SMA (SMA UK Consorzio; T.H.G. & Y-T. H.), SMA Europa (Tarantino, D.v.D.H. ed E.J.N.G.), il DTP di Università di Edimburgo in precisione medicina (T.H.G., L.L. & A.M.M.) e il centro di Euan MacDonald per ricerca di malattia del motoneurone (Tarantino).
Materials
| Fine Tipped Gel Loading Tips | Alpha Laboratories | GL20057SNTL | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-free 100x 5mL | ThermoFisher Scientific | 78437 | |
| Handheld homogeniser | VWR Collection | 431-0100 | |
| iBlot 2 Gel Transfer Device | ThermoFisher Scientific | IB21001 | |
| iBlot Transfer Stack, PVDF, regular size | ThermoFisher Scientific | IB401031 | |
| Image Studio Lite | Licor | N/A | Free download from https://www.licor.com/bio/products/software/image_studio_lite/ |
| IRDye 800CW secondary antibodies | Licor | — | Select appropriate secondary antibody that is specific against host of primary antibody. |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| Novex Sharp Pre-stained Protein Standard | ThermoFisher Scientific | LC5800 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well | ThermoFisher Scientific | NP0323BOX | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | ThermoFisher Scientific | NP0007 | |
| NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20X) | ThermoFisher Scientific | NP0001 | |
| Odyssey Blocking Buffer | Licor | 927-40000 | |
| Purified Mouse anti-SMN (survival motor neuron) monoclonal antibody | BD Transduction Laboratories | 610646 | Is used extensively in the SMN/SMA literature and gives consistent results regardsless of lot number |
| REVERT Total Protein Stain, 250 mL | Licor | 926-11021 | |
| REVERT Wash Solution | Licor | 926-11012 | |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher Scientific | EI0001 |
Referências
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