संश्लेषण, Functionalization, और के लक्षण वर्णन फ्यूजेनिक छिद्रपूर्ण सिलिकॉन के लिए नैनो कणों के लिए ओलिगोन्यूक्लियोटाइड डिलिवरी
Summary
हम विट्रो में प्रभावी और vivo ओलिगोन्यूक्लिओटाइड डिलीवरी में के लिए फ्यूजेनिक झरवाला सिलिकॉन नैनोकणों के संश्लेषण का प्रदर्शन । छिद्रक सिलिकॉन नैनोकणों के लिए कोर, जो बाहर निकालना के माध्यम से फ्यूजेनिक रक्तदाब द्वारा लेपित है बनाने के लिए सिरना के साथ लोड कर रहे है खोल फार्म । लक्ष्यीकरण मोइटी functionalization और कण लक्षण वर्णन शामिल हैं ।
Abstract
जीन थेरेपी के आगमन के साथ, vivo न्यूक्लिओटाइड में एक प्रभावी विकास-पेलोड डिलीवरी प्रणाली समानांतर आयात की बन गई है । फ्यूजेनिक झरनी सिलिकॉन नैनोकणों (एफ psinps) हाल ही में अपने उच्च ओलिगोन्यूक्लिओटाइड लदान क्षमता और अद्वितीय सेलुलर तेज मार्ग है कि endocytosis से बचा जाता है के कारण vivo जीन मुंह बंद प्रभावकारिता में उच्च प्रदर्शन किया है । एफ pSiNPs के संश्लेषण एक बहु कदम प्रक्रिया है कि शामिल है: (1) लोड हो रहा है और सिलिकॉन pores में oligonucleotide पेलोड की सील; (2) एक साथ कोटिंग और छिद्रित सिलिकॉन कोर के आसपास फ्यूजेनिक लिपिड की नौकरशाही का आकार घटाने; और (3) पेप्टाइड्स लक्ष्यीकरण का संयुग्मन और अतिरिक्त oligonucleotide को हटाने के लिए धोने, सिलिकॉन मलबे, और पेप्टाइड. कण के आकार एकरूपता गतिशील प्रकाश बिखरने की विशेषता है, और इसकी कोर-शैल संरचना संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा सत्यापित किया जा सकता है । फ्यूजेनिक भार एक लिपोफिलिक डाई, 1, 1 ‘-डिओटाडेसिल-3, 3, 3 ‘, 3 ‘-टेट्रामेथालिनडोकार्बोसायनीन परक्लोरेट (DiI), फ्यूजेनिक लिपिड bilayer में लोड हो रहा है और यह विट्रो में कोशिकाओं के इलाज के लिए प्लाज्मा झिल्ली धुंधला बनाम के लिए निरीक्षण endocytic localizations. लक्ष्यीकरण और vivo जीन मुंह बंद एफिशियोस में पहले staphylococcus औरेयस निमोनिया के एक माउस मॉडल में मात्रा निर्धारित थे, जिसमें लक्ष्यीकरण पेप्टाइड को संक्रमण की साइट के लिए घर के लिए एफ psinps मदद की उंमीद है । एस ऑरेयस संक्रमण में अपने आवेदन से परे, एफ psinp प्रणाली वायरल संक्रमण, कैंसर, और स्व-प्रतिरक्षित रोगों सहित रोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के जीन थेरेपी के लिए किसी भी ओलिगोन्यूक्लिओटाइड देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Introduction
जीन थेरेपी एक चिकित्सीय परिणाम प्राप्त करने के लिए विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति modulates । जीन मॉडुलन के लिए अनेक उपकरणों की खोज की गई है और अध्ययन किया गया है, जिनमें राइबोन्यूक्लीइक अम्ल हस्तक्षेप (आरएनआई) का उपयोग करके ओलिगोन्यूक्लिओटिडेस (उदा., लघु दखल आरएनए (सिरना)1,2, माइक्रोना (मिरना)3,4 ), डीएनए plasmids5,6, नाभिकों (जैसे, जस्ता उंगली, टैलेंस)7,8, और crispr/Cas9 सिस्टम9,10. जबकि कार्रवाई के प्रत्येक उपकरण के तंत्र अलग है, उपकरण के सभी सेल के कोशिका द्रव्य या नाभिक सक्रिय होने के लिए पहुंचना चाहिए । जैसे, जबकि इन उपकरणों के लिए विट्रो में जीन अभिव्यक्ति नियमन में महत्वपूर्ण प्रभाव पैदा साबित कर दिया है, vivo प्रभावकारिता में extracellular और intracellular बाधाओं से ग्रस्त है । तथ्य यह है कि उपकरण जैविक मूल के हैं के कारण, कई एंजाइम और निकासी प्रणाली हमारे शरीर में मौजूद है कि नीचा या विदेशी अणुओं को दूर करने की क्षमता है11. इस स्थिति में भी कि उपकरण लक्ष्य कक्ष तक पहुंचते हैं, वे endocytosis से पीड़ित हैं; सेलुलर की एक विधा जो कोशिका के बाहर के औजार को नीचा या निष्कासित करने वाली अम्लीय पेट की तरह उपकरण को संपुटित और जाल में झोंक लेती है । वास्तव में, अध्ययनों से पता चला है कि लिपिड नैनोकणों मैक्रोपिनोसाइटोसिस के माध्यम से endocytosed रहे हैं, जिसमें से लगभग ७०% सिरना के 24घंटे के भीतर कोशिकाओं से exocytosed हैं12,13। शेष सिरना के बहुमत लायोसोमल मार्ग के माध्यम से अपमानित कर रहे हैं, और अंततः केवल 1-2% सिरना है कि शुरू में नैनोकणों के साथ सेल में प्रवेश करती है एंडोसोमल एस्केप प्राप्त करने के लिए संभावित रूप से गुजरना rnai13,14 .
हम हाल ही में फ्यूजेनिक झरवाला सिलिकॉन नैनोकणों (एफ psinps) है कि एक सिरना भरी हुई है विकसित की है झरझरा सिलिकॉन नैनोकणों से बना कोर, और एक फ्यूजेनिक लिपिड शैल15। एफ psinps अन्य पारंपरिक oligonucleotide वितरण प्रणाली पर तीन प्रमुख लाभ वर्तमान: (1) एक फ्यूजेनिक लिपिड कोटिंग जो endocytosis बाईपास करने के लिए कणों को सक्षम बनाता है और पूरे पेलोड सीधे सेल कोशिका द्रव्य में देने के लिए (बनाम 1-2% 13,14endocytosed कणों द्वारा प्राप्त) (चित्रा 1); (2) pSiNPs में सिरना की उच्च मास लोडिंग (> 20 wt% पारंपरिक सिस्टम द्वारा 1-15 wt% की तुलना में)15, जो तेजी से साइटोप्लाज्म में नीचा (एक बार कोर कणों फ्यूजेनिक तेज के माध्यम से लिपिड कोटिंग शेड) सिरना रिहाई के लिए; और (3) vivo में वांछित सेल प्रकार के लिए चयनात्मक अभिलक्ष्यन के लिए पेप्टाइड संयुग्मन लक्ष्यीकरण ।
एफ-पीसीएनपी प्रणाली ने महत्वपूर्ण जीन साइलेंसिंग प्रभावकारिता (विट्रो में > 95%; वीवो में > 80%) तथा एस-ऑरियस निमोनिया के घातक माउस मॉडल में अनुवर्ती चिकित्सीय प्रभाव का प्रदर्शन किया है; जिसके परिणाम पहले15प्रकाशित किए गए थे । हालांकि, एफ pSiNP प्रणाली की जटिल संरचना नाजुक हैंडलिंग और ठीक tuned अनुकूलन के लिए वर्दी और स्थिर नैनोकणों उत्पंन करने की आवश्यकता है । इस प्रकार, इस काम का उद्देश्य एक संपूर्ण प्रोटोकॉल पेश करने के लिए है, साथ ही संश्लेषण के लिए अनुकूलन रणनीतियों, functionalization, और एफ pSiNPs के लक्षण वर्णन शक्तिशाली जीन साइलेंसिंग प्रभाव के लिए सिरनास के लक्षित डिलीवरी में इस्तेमाल किया जाएगा ।
Protocol
Representative Results
Discussion
छिद्रक सिलिकॉन नैनोकणों का संश्लेषण चित्रा 5में दिखाया गया है । फ्यूजेनिक pSiNPs के संश्लेषण में महत्वपूर्ण कदम लोड हो रहा है कदम (चरण 3) में है । यदि फ्यूजेनिक नैनोकणों के बाद संश्लेषण (च?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह कार्य अनुबंध # R01 AI132413-01 के माध्यम से स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा समर्थित है ।
Materials
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) | Avanti Polar Lipids | 850345P | Powder |
| 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (chloride salt) (DOTAP) | Avanti Polar Lipids | 890890P | Powder |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG(2000) Maleimide) | Avanti Polar Lipids | 880126P | Powder |
| Aluminum foil | VWR International, LLC | 12175-001 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Spectrum | C1977 | Anhydrous, Pellets |
| Chloroform | Fisher Scientific | C6061 | |
| Computer | Dell | Dimension 9200 | Any computer with PCI card slot is acceptable |
| Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3))) | Life Technologies | D3911 | |
| Ethanol (EtOH) | UCSD Store | 111 | 200 Proof |
| Hydrofluric acid (HF) | VWR International, LLC | MK264008 | Purity: 48% |
| Keithley 2651a Sourcemeter | Keithley | 2651A | |
| LabVIEW | National Instruments | Sample program available at: http://sailorgroup.ucsd.edu/sofware/ | |
| LysoTracker Green DND-26 | Thermo Fisher Scientific | L7526 | |
| Liposome extrusion set with heating block | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
| Microcon-30kDa Centrifugal Filter Unit | EMD Millipore | MRCF0R030 | |
| O-ring | ChemGlass | CG-305-220 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-049 | |
| Platinum coil | VWR International, LLC | AA10285-BU | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Fisher Scientific | P250-3 | |
| Silicon wafer | Siltronix | Custom order | |
| siRNA | Dharmacon | Custom order | IRF5, sense 5’-dTdT-CUG CAG AGA AUA ACC CUG A-dTdT-3’ and antisense 5’-dTdT UCA GGG UUA UUC UCU GCA G dTdT-3’ |
| Sonicator | VWR International, LLC | 97043-960 | |
| Targeting peptide (CRV) | CPC Scientific | Custom order | sequence CRVLRSGSC; made cyclic by a disulfide bond between the side chains of the two cysteine residues |
| Teflon etch cell | Interface Performance Materials, Inc. | Custom order | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 10977015 |
Referências
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