Functionalization, malzemelerin ve Fusogenic gözenekli Silisyum nano tanecikleri'Oligonükleotid dır
Summary
Fusogenic gözenekli Silisyum nano tanecikleri etkili tüp bebek ve içinde vivo Oligonükleotid tesliminde sentezi göstermektedir. Gözenekli Silisyum nano tanecikleri tarafından fusogenic lipidler kabuk oluşturmak için ekstrüzyon ile kaplı çekirdek oluşturmak üzere siRNA ile yüklenir. Hedefleme yan functionalization ve parçacık karakterizasyonu yer almaktadır.
Abstract
Gen tedavisi ve advent ile bir etkili içinde vivo nükleotit yükü gönderim sisteminin geliştirilmesi paralel ithalat haline gelmiştir. Fusogenic gözenekli Silisyum nano tanecikleri (F-pSiNPs) son zamanlarda yüksek içinde vivo gen etkinliği nedeniyle yükleme kapasitesi ve endositoz önler benzersiz hücresel alımı yolu onun yüksek Oligonükleotid susturmak gösterdi. F-pSiNPs sentezi içeren çok adımlı bir işlemdir: (1) yükleme ve in silikon gözenekleri; Oligonükleotid payloads mühürleme (2) aynı anda kaplama ve fusogenic lipidler gözenekli Silisyum çekirdek çevresinde boyutlandırma; ve peptidler hedefleme ve aşırı Oligonükleotid, silikon enkaz ve peptid kaldırmak için yıkama (3) oluşun. Parçacığın boyutu tekdüzelik dinamik ışık saçılma ile karakterizedir ve çekirdek-kabuk yapısını iletim elektron mikroskobu tarafından doğrulanmadı. Fusogenic alımını bir lipofilik yükleyerek doğrulanır, 1, 1′-dioctadecyl-3,3, 3′, 3′-tetramethylindocarbocyanine perklorat (dıı), fusogenic lipid bilayer boya ve hücrelere plazma zarı karşı boyama için gözlemlemek için tüp bebek tedavisi endositik yerelleştirmeler. Hedefleme ve içinde vivo gen silencing efficacies daha önce Staphylococcus aureus pnömoni, hangi hedefleme peptid enfeksiyon sitesine giriş için F-pSiNPs yardım bekleniyor, bir fare modeli sayısal. S. aureus enfeksiyon kendi uygulamasında, F-pSiNP sistemi hastalıkları, viral enfeksiyonlar, kanser ve otoimmün hastalıklar da dahil olmak üzere geniş bir gen tedavisi için herhangi bir Oligonükleotid teslim etmek için kullanılabilir.
Introduction
Gen tedavisi tedavi edici bir sonuç elde etmek için belirli bir gen ifade modüle. Gen modülasyon için çok sayıda araç keşfetti ve okudu, oligonucleotides (örneğin, kısa sokan RNA (siRNA)1,2, mikroRNA (miRNA)3,4 kullanarak ribonükleik asit girişim de dahil olmak üzere (RNAi) ), DNA plazmid5,6, enzimler (örneğin, çinko parmak, TALENS)7,8ve CRISPR/Cas9 sistemleri9,10. Her aracın etki mekanizması farklı olsa da, tüm araçları hücrenin sitoplazma veya aktif olmak için çekirdek ulaşmak gerekir. Bu nedenle, bu araçları gen ekspresyonu tüp bebek oransal olarak önemli etkisi ikna etmek için kanıtlanmış olsa da, içinde vivo etkinliği hücre içi ve hücre dışı engel uğrar. Biyolojik kökenlidir araçlar nedeniyle gerçeğini, düşebilir veya yabancı molekülleri11Kaldır seçeneğine sahipsiniz vücudumuzda birçok enzim ve temizleme sistemleri mevcut. Durumda bile araçları hedef hücre ulaşmak endositoz acı; bir mod, saklar ve aşağılamak veya hücre dışı araçlar sınırdışı asitli mide benzeri veziküller araçlarında yakalar hücresel Alım. Aslında, çalışmalar lipid nano tanecikleri içinden alımı12,1324 h içinde hücrelerden siRNA yaklaşık % 70’i exocytosed macropinocytosis, via endocytosed olduğunu göstermiştir. Kalan siRNA çoğunluğu lizozomal yolu ile bozulmuş ve sonuçta RNAi13,14 potansiyel olarak geçmesi endosomal kaçış elde başlangıçta nano tanecikleri ile hücreye girer siRNA, sadece 1-%2 .
Biz son zamanlarda gözenekli Silisyum nano tanecikleri ve fusogenic lipid kabuk15oluşan bir siRNA yüklenen çekirdek olan fusogenic gözenekli Silisyum nano tanecikleri (F-pSiNPs) geliştirdik. F-pSiNPs diğer geleneksel Oligonükleotid vasıtalarının üzerinde üç büyük avantajları sunmak: (1) bir fusogenic lipid endositoz bypass ve tüm yükü (1-%2 karşı hücreyi sitoplazmada doğrudan teslim parçacıklar sağlayan kaplama endocytosed parçacıklar13,14tarafından elde) (Resim 1); pSiNPs siRNA (2) yüksek toplu yükleme (> 20 wt % 1-15 wt % tarafından geleneksel sistemleri ile karşılaştırıldığında) bir kez (çekirdek parçacıkları lipid kaplama fusogenic alımı ile shed) hangi hızla siRNA; serbest bırakmak içinde sitoplazma aşağılamak15, ve (3) peptid konjugasyon için seçici posta için hedefleme istenen hücre tipleri içinde vivo.
F-pSiNP sistemi önemli gen etkinliğini susturmak göstermiştir (> % 95’in vitro; > % 80’i içinde vivo) ve sonraki tedavi etkisi bir ölümcül fare modeli S. aureus pnömoni; sonuçlarını hangi daha önce15yayınlandı. Ancak, hassas işleme ve ince ayar en iyi duruma getirme düzgün ve istikrarlı nano tanecikleri oluşturmak için F-pSiNP sisteminin karmaşık yapısını gerektirir. Böylece, bu çalışmanın amacı ayrıntılı bir protokol yanı sıra, functionalization, malzemelerin ve çift hedeflenen teslimini güçlü gen susturmak etkisi için kullanılmak üzere F-pSiNPs için en iyi duruma getirme stratejileri sunmaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gözenekli Silisyum nano tanecikleri sentezi şekil 5‘ te gösterilen. Fusogenic pSiNPs sentezi kritik adımda yükleme adım (Adım 3) var. Fusogenic nano tanecikleri toplayarak Eğer sonrası sentezi (şekil 3), nedeni aşağıdaki nedeniyle olabilir: (1) Kalsiyum klorür stok rastlanılmaması hazırlanan değil, böylece adım 3.1.2 olmalı dikkatle takip veya rafine; veya (2) pSiNP oranı: siRNA: CaCl2 veya bir veya daha fazla üç bileşeni kons…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser Ulusal Sağlık Enstitüleri ile tarafından desteklenen sözleşme # R01 AI132413-01.
Materials
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) | Avanti Polar Lipids | 850345P | Powder |
| 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (chloride salt) (DOTAP) | Avanti Polar Lipids | 890890P | Powder |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG(2000) Maleimide) | Avanti Polar Lipids | 880126P | Powder |
| Aluminum foil | VWR International, LLC | 12175-001 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Spectrum | C1977 | Anhydrous, Pellets |
| Chloroform | Fisher Scientific | C6061 | |
| Computer | Dell | Dimension 9200 | Any computer with PCI card slot is acceptable |
| Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3))) | Life Technologies | D3911 | |
| Ethanol (EtOH) | UCSD Store | 111 | 200 Proof |
| Hydrofluric acid (HF) | VWR International, LLC | MK264008 | Purity: 48% |
| Keithley 2651a Sourcemeter | Keithley | 2651A | |
| LabVIEW | National Instruments | Sample program available at: http://sailorgroup.ucsd.edu/sofware/ | |
| LysoTracker Green DND-26 | Thermo Fisher Scientific | L7526 | |
| Liposome extrusion set with heating block | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
| Microcon-30kDa Centrifugal Filter Unit | EMD Millipore | MRCF0R030 | |
| O-ring | ChemGlass | CG-305-220 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-049 | |
| Platinum coil | VWR International, LLC | AA10285-BU | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Fisher Scientific | P250-3 | |
| Silicon wafer | Siltronix | Custom order | |
| siRNA | Dharmacon | Custom order | IRF5, sense 5’-dTdT-CUG CAG AGA AUA ACC CUG A-dTdT-3’ and antisense 5’-dTdT UCA GGG UUA UUC UCU GCA G dTdT-3’ |
| Sonicator | VWR International, LLC | 97043-960 | |
| Targeting peptide (CRV) | CPC Scientific | Custom order | sequence CRVLRSGSC; made cyclic by a disulfide bond between the side chains of the two cysteine residues |
| Teflon etch cell | Interface Performance Materials, Inc. | Custom order | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 10977015 |
References
- Ryther, R. C. C., Flynt, A. S., Phillips Iii, J. A., Patton, J. G. siRNA therapeutics: big potential from small RNAs. Gene Therapy. 12, 5 (2004).
- Scherman, D., Rousseau, A., Bigey, P., Escriou, V. Genetic pharmacology: progresses in siRNA delivery and therapeutic applications. Gene Therapy. 24, 151 (2017).
- Broderick, J. A., Zamore, P. D. MicroRNA therapeutics. Gene Therapy. 18, 1104 (2011).
- Geisler, A., Fechner, H. MicroRNA-regulated viral vectors for gene therapy. World Journal of Experimental Medicine. 6 (2), 37-54 (2016).
- Williams, P. D., Kingston, P. A. Plasmid-mediated gene therapy for cardiovascular disease. Cardiovascular Research. 91 (4), 565-576 (2011).
- Ferreira, G. N. M., Monteiro, G. A., Prazeres, D. M. F., Cabral, J. M. S. Downstream processing of plasmid DNA for gene therapy and DNA vaccine applications. Trends in Biotechnology. 18 (9), 380-388 (2000).
- Shim, G., et al. Therapeutic gene editing: delivery and regulatory perspectives. Acta Pharmacologica Sinica. 38, 738 (2017).
- Carlson, D. F., Fahrenkrug, S. C., Hackett, P. B. Targeting DNA With Fingers and TALENs. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 1, (2012).
- Dai, W. -. J., et al. CRISPR-Cas9 for in vivo Gene Therapy: Promise and Hurdles. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 5, e349 (2016).
- Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communications. 9 (1), 1911 (2018).
- Houseley, J., Tollervey, D. The Many Pathways of RNA Degradation. Cell. 136 (4), 763-776 (2009).
- Sahay, G., et al. Efficiency of siRNA delivery by lipid nanoparticles is limited by endocytic recycling. Nature Biotechnology. 31 (7), 653-658 (2013).
- Wang, Y., Huang, L. A window onto siRNA delivery. Nature Biotechnology. 31 (7), 611-612 (2013).
- Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nature Biotechnology. 31 (7), 638-646 (2013).
- Kim, B., et al. Immunogene therapy with fusogenic nanoparticles modulates macrophage response to Staphylococcus aureus. Nature Communications. 9 (1), 1969 (2018).
- Zhang, X., et al. Targeted Disruption of G<sub>0</sub>/G<sub>1</sub> Switch Gene 2 Enhances Adipose Lipolysis, Alters Hepatic Energy Balance, and Alleviates High-Fat Diet–Induced Liver Steatosis. Diabetes. 63 (3), 934-946 (2014).
- Schlosser, K., Taha, M., Deng, Y., Stewart, D. J. Systemic delivery of MicroRNA mimics with polyethylenimine elevates pulmonary microRNA levels, but lacks pulmonary selectivity. Pulmonary Circulation. 8 (1), 2045893217750613 (2018).
- Komarov, A. P., et al. Functional genetics-directed identification of novel pharmacological inhibitors of FAS- and TNF-dependent apoptosis that protect mice from acute liver failure. Cell Death & Disease. 7, e2145 (2016).
