Real-time i Vitro overvågning af lugtstof Receptor aktivering af en lugtstof i fasen for damp

Summary

Fysiologisk, aktiveres lugtstof receptorer af lugtstof molekyler inhaleret i fasen for damp. Dog anvender mest in vitro-systemer flydende fase lugtstof stimulation. Vi præsenterer her, en metode, der giver mulighed for real-time in vitro-overvågning af lugtstof receptor aktivering efter lugtstof stimulation i vapor fase.

Abstract

Olfaktoriske perception begynder med samspillet mellem duftstoffer med lugtstof receptorer (eller) udtrykt af olfaktoriske sensoriske neuroner (OSN). Lugt anerkendelse følger en kombinatorisk kodning ordningen, hvor en OR kan aktiveres ved et sæt af Duftenes og én lugtstof kan aktivere en kombination af ORs. Gennem sådanne kombinatorisk kodning, kan organismer registrere og skelne mellem et utal af flygtige lugt molekyler. En lugt ved en given koncentration kan således betegnes ved en aktivering mønster af ORs, der er specifikke for hver lugt. I forstand, revner de mekanismer, som hjernen bruger til at opfatte lugt kræver forståelse lugtstof-OR interaktioner. Dette er grunden til, at Fællesskabets lugtesansen er forpligtet til at “de-orphanize” Disse receptorer. Konventionelle in vitro-systemer anvendes til at identificere lugtstof- eller interaktioner har udnyttet kvægbruget celle medier med lugtstof, som er forskellig fra den naturlige påvisning af lugte via damp Duftenes opløsning i næseslimhinden før interagere med ORs. Her, beskriver vi en ny metode, der giver mulighed for tidstro overvågning af OR aktivering via damp-fase duftstoffer. Vores metode er baseret på måling lejr frigivelse af luminescence ved hjælp af Glosensor assay. Det broer nuværende huller mellem in vivo og in vitro-metoder og danner grundlag for en biomimetiske flygtige kemiske sensor.

Introduction

Lugtesansen giver mulighed for terrestriske dyr til at interagere med deres flygtige kemiske miljø til kørsel adfærd og følelser. Fundamentalt, lugt afsløring proces begynder med den første interaktion af lugtstof molekyler med det olfaktoriske system, på niveauet af lugtstof receptorer (ORs)¹. I pattedyr udtrykkes ORs individuelt i olfaktoriske sensoriske neuroner (OSNs) beliggende i Lugtepithelet². De tilhører familien G-protein koblet receptor (GPCR) og mere præcist den rhodopsin-lignende undergruppe (også kaldet klasse A). ORs par med den stimulerende G protein G_olf hvis aktivering fører til cAMP produktion efterfulgt af åbningen af cykliske nukleotid gated-kanaler og generation af handling potentialer. Det er accepteret, at en lugt percept bygger på et bestemt mønster af aktiverede ORs^3,4 og derfor lugt anerkendelse følger en kombinatorisk kodning ordningen, hvor en OR kan aktiveres ved et sæt af Duftenes og én lugtstof kan aktivere en kombination af ORs. Og gennem sådanne kombinatorisk kodning, det er postuleret at organismer kan registrere og skelne mellem et utal af flygtige lugt molekyler. En af nøglerne til forståelsen af hvordan lugt opfattes er at forstå, hvordan og hvilke ORs er aktiveret af en given lugt.

I et forsøg på at belyse lugtstof- eller interaktioner, in vitro-funktionelle assays har spillet en væsentlig rolle. Identifikation af agonist lugtende ligander for sjældne ORs (OR nedtrapning orphanization) har været en meget aktiv inden for de sidste tyve år, ved hjælp af forskellige in vitro ex vivo og in vivo funktionelle assays^{5,6,7 ,8,9,10,11,12,13,14,15,16, 17}.

In vitro assay systemer er bedst egnet til den detaljerede funktionelle karakterisering af ORs, herunder identifikation af funktionelle domæner og kritisk rester af ORs, såvel som potentielle ingeniørmæssige anvendelser. Dog, yderligere udvikling af værdifulde in vitro-systemer til ORs har været en udfordring, dels på grund af vanskeligheder med dyrkningsbaserede OSNs og funktionelle udtryk af ORs i heterolog celler. Den første udfordring var at fastlægge protokoller, der er tilladt for celle overflade udtryk for funktionelle ORs i kortlægningen af lugtstof-OR interaktioner. En række uafhængige grupper har udnyttet forskellige tilgange^{5,6,7,8,9,10,11,12, 14,18,19,20}. Et af de tidligste resultater blev foretaget af Krautwurst et al. i markeret N-terminalen af ORs med en forkortet sekvens af rhodopsin (Rho-tag) og observeret en forbedret overflade udtryk i menneskelige embryonale nyre (HEK) celler¹³. Ændringer til koden knyttet til OR sekvens er stadig en sti udforskes for at forbedre OR udtryk og funktionalitet^19,21. Saito mfl. derefter identificeret receptor-transport protein 1 (RTP1) og RTP2, som letter OR handel. ²² en kortere version af RTP1, kaldet RTP1S, har også vist sig at være endnu mere effektiv end den oprindelige protein²³. Udviklingen af en cellelinje (Hana3A), som stabilt udtrykker G_olf, REEP1, RTP1 og RTP2 ²⁴, kombineret med brugen af cyklisk adenosin fra (cAMP) journalister har muliggjort identifikation af lugtstof-OR interaktioner. Den mekanisme, hvormed RTP receptorgruppen af proteiner fremmer celle overflade udtryk af ORs stadig skal fastlægges.

En advarsel af disse etablerede metoder er at de er afhængige af lugtstof stimulation i flydende fase, hvilket betyder at Duftenes pre opløses i en stimulation medium og stimulere cellerne ved at erstatte mediet. Dette er meget forskellige fra de fysiologiske tilstande hvor lugtstof molekyler nå Lugtepithelet i vapor fase og aktivere ORs ved opløsning i næseslimhinden. For at mere ligner fysiologisk relevante stimulus eksponering, Sanz et al.²⁰ foreslås en analyse baseret på vapor stimulation ved at anvende en dråbe af lugtstof løsning at hænge under indersiden af plastfolie placeret på toppen af celle brønde. De indspillede calcium svar ved at overvåge fluorescens intensitet. Denne metode var først til at bruge air-fase lugtstof stimulation, men det tillade ikke en stor screening af OR aktivering.

Her, udviklet vi en ny metode, der muliggør real-time overvågning af in vitro-OR aktivering via damp fase lugtstof stimulation af Glosensor assay (figur 1). Denne analyse har været anvendt tidligere i forbindelse med flydende lugtstof stimulation^{18,19,25,26,27,28,29, 30 , 31}. luminometrisk overvågning kammer er først ekvilibreres med forstøvet lugtstof før pladen læsning (figur 1A). Lugtstof molekyler er derefter solvated i bufferen, badning Hana3A celler, der udtrykker eller interesse, RTP1S og Glosensor proteiner (figur 1B). Hvis lugtstof er en agonist i regionerne, vil eller skifte til en aktiveret kropsbygning og binde G_olf, aktivering adenylyl cyclase (AC) og i sidste ende medføre lejr niveauer til at stige. Denne stigende cAMP vil binder til og aktivere Glosensor proteinet til at generere luminescence katalysere luciferin. Denne luminescence registreres derefter af en luminometrisk og muliggør OR aktivering overvågning. Denne metode er af stor interesse i forbindelse med OR deorphanization som det bringer in vitro-systemer tættere på den fysiske opfattelse af lugte.

Protocol

1. Hana3A celler kultur Forberede M10 (Minimum afgørende Medium (MEM) plus 10% v/v føtal bovint serum (FBS)) og M10PSF (M10 plus 100 µg/mL penicillin-streptomycin og 1,25 µg/mL amphotericin B). Kultur celler i 10 mL af M10PSF i en 100 mm celle kultur fad i en inkubator, indstillet på 37 ° C og 5% kuldioxid (CO2). Opdele celler hver 2 dage på en 20% ratio: når 100% sammenløbet af celler (ca 1,1 x 107 celler) er observeret under et fasekontrast mikroskop, aspire …

Representative Results

Vi gennemgået tre mus ORs, Olfr746, Olfr124 og Olfr1093 reaktion ved hjælp af cinnamaldehyd damp stimulation (figur 3). Samtidig, vi brugte en tom vektor kontrol (Rho-pCI) til at forsikre, at de testede ORs lugtstof-induceret aktiviteter var specifikke (fig. 3A). Real-time aktivering af ORs på vapor lugtstof stimulus blev overvåget over 20 måling cyklusser. Data for hver blev godt først normaliseret til tomme vektor kontrol i gennemsnit v?…

Discussion

Opfattelsen af lugt er grundlæggende afhængig af aktivering af ORs. Dermed, forståelse af deres funktionalitet er krævede hen til knæk de komplekse mekanismer, som hjernen bruger til at opfatte sin flygtige kemiske miljø. Men forståelsen af denne proces er blevet hæmmet af vanskelighederne med at etablere en robust metode til at screene OR repertoire for funktionalitet mod Duftenes in vitro-. Celle overflade og heterolog udtryk af ORs er blevet delvist løst ved oprettelsen af mærket receptorer<sup clas…

Materials

0.05 % trypsin-EDTA	Gibco	25300-054	0.05% Trypsin – EDTA (1x), phenol red – store at 4°C
100 mm cell culture dish	BD Falcon	353003	100 mm x 20 mm cell culture dish
15 mL tube	BD Falcon	352099	17 mm x 120 mm conical tubes
96-well plate	Corning	3843	96 well, with LE lid white with clear bottom Poly-D-lysine coated Polystyrene
Amphotericin	Gibco	15290-018	Amphotericin B 250 µg/mL – store at 4°C
centrifuge machine	Jouan	C312	Centrifuge machine with swinging bucket rotor for 15 mL
Class II Type A/B3 fumehood	NUAIRE	NU-407-500	fumehood for cell culturing
FBS	Gibco	16000-044	Fetal Bovine Serum – store at -20°C
GloSensor cAMP Reagent	Promega	E1290	GloSensor cAMP Reagent luminescent protein substrate – store at -20°C
Incubator 37 °C; 5 % CO2	Fisher Scientific	11-676-604	Incubator for cell culturing
Lipofectamine 2000 reagent	Invitrogen	11668-019	Lipofectamine 2000 Reagent 1mg/ml transfection reagent – store at 4°C
Luminometer POLARstar OPTIMA	BMG LABTECH	discontinued	96 well plate reader for luminescence
Mineral oil	Sigma	M8410	Solvent for odorants – store at room temperature
Minimum Essential Medium (MEM)	Corning cellgro	10-010-CV	Minimum Essential Medium Eagle with Earle’s salts & L-glutamine – store at 4°C
Penicillin/Streptomycin	Sigma Aldrich	P4333	Penicillin-Streptomycin solution stabilized with 10,000 U of penicillin and 10 mg streptomycin – store at -20°C
pGlosensor	Promega	E2301	pGloSensor-22F cAMP luminescent protein plasmid – store at 4°C
phase contrast microscope	Leica	090-131.001	phase contrast microscope with x4, x10, x20 objectives
RTP1S	H. Matsunami lab	–	100 ng/µL plasmid – store at 4°C