Real-Time In Vitro Monitoring van Odorant Receptor activering door een Odorant in de damp-fase

Summary

Fysiologisch, worden odorant receptoren geactiveerd door odorant moleculen in de fase van de damp ingeademd. Echter, meest in vitro systemen gebruiken vloeibare fase odorant stimulatie. Hier presenteren we een methode waarmee in vitro bewaking in real-time van odorant receptor activering op odorant stimulatie in damp fase.

Abstract

Olfactorische waarneming begint met de interactie van odorant met odorant receptoren (of) uitgedrukt door olfactorische sensorische neuronen (OSN). Geur erkenning volgt een combinatorische coderingsschema dat, waar een OR kan worden geactiveerd door een reeks van odorant en één odorant kan het activeren van een combinatie van ultraperifere regio’s. Door dergelijke combinatorische codering, kunnen organismen detecteren en onderscheid maken tussen een groot aantal vluchtige geur moleculen. Dus, een geur met een bepaalde concentratie kan worden beschreven door een patroon voor activering van ultraperifere regio’s, die specifiek is voor elke geur. In die zin, het kraken van de mechanismen die de hersenen gebruikt voor het waarnemen van geur vereist het begrip odorant-OR interacties. Dit is de reden waarom de reukzin Gemeenschap streeft naar “–orphanize” deze receptoren. Conventionele in vitro systemen gebruikt voor het identificeren van odorant- of interacties drachtige cel media met odorant, hebben gebruikt die verschilt van de natuurlijke detectie van geuren via damp odorant ontbinding in nasale mucosa voor interactie met ORs. Hier beschrijven we een nieuwe methode waarmee real-time bewaking van OR activering via damp-fase odorant. Onze methode is afhankelijk van de cAMP release door luminescentie met behulp van de bepaling van de Glosensor meten. Het huidige verschillen tussen de in vivo en in vitro benaderingen overbrugt en vormt de basis voor een biomimetische vluchtige chemische sensor.

Introduction

De betekenis van geur kunt landdieren om te interageren met hun vluchtige chemische omgeving station gedrag en emoties. Fundamenteel, is het detectieproces geur begint met de allereerste interactie van odorant moleculen met de olfactorische systeem, op het niveau van odorant receptoren (ORs)¹. ORs worden individueel zoogdieren uitgedrukt in olfactorische sensorische neuronen (OSNs) gelegen in de olfactorische epitheel². Zij behoren tot de familie van de G-eiwit gekoppelde receptor (GPCR) en precies te zijn naar de subgroep van rodopsine-achtige (ook wel klasse A). ORs paar met de stimulerend G eiwit G_olf wiens Activering tot cAMP productie leidt, gevolgd door de opening van cyclische nucleotide gated kanalen en de generatie van de actie potentieel. Het is geaccepteerd dat een geur percept is afhankelijk van een specifiek patroon van geactiveerde ORs^3,4 en geur erkenning een combinatorische coderingsschema dat volgt, waar een OR kan worden geactiveerd door een reeks van reukstoffen en één odorant kunt activeren een combinatie van ultraperifere regio’s. En door middel van dergelijke combinatorische codering, het is gepostuleerd dat organismen kunnen detecteren en onderscheid tussen een groot aantal vluchtige geur moleculen maken. Een van de sleutels tot het inzicht hoe geuren worden waargenomen is te begrijpen hoe en die ultraperifere regio’s worden geactiveerd door een bepaalde geur.

In een poging om het verhelderen van odorant- of interacties, in vitro functionele testen een essentiële rol hebben gespeeld. De identificatie van de agonist geurige liganden voor wees ORs (OR ambtshalve orphanization) is een zeer actief gebied geweest voor de afgelopen twintig jaar, door het gebruik van diverse in vitro, ex vivo en in vivo Functionele assays^{5,6,7 ,8,9,10,11,12,13,14,15,16, 17}.

In-vitro-assay systemen zijn zeer geschikt voor de gedetailleerde functionele karakterisering van ultraperifere regio’s, met inbegrip van identificatie van de functionele domeinen en kritische residuen van ultraperifere regio’s, evenals mogelijke waterbouwkundige toepassingen. Ontwikkeling van waardevolle in vitro systemen voor ultraperifere regio’s is echter verder een uitdaging, gedeeltelijk als gevolg van problemen met kweken OSNs en functionele expressie van ultraperifere regio’s in heterologe cellen geweest. De eerste uitdaging was geweest om de protocollen die voor de cel-oppervlakte expressie van functionele ultraperifere regio’s in de toewijzing van odorant toegestaan-OR interacties. Een aantal onafhankelijke groepen hebben gebruikt verschillende benaderingen^{5,6,7,8,9,10,11,12, 14},^,18,19,20. Een van de vroegste successen geboekt door Krautwurst et al. gelabeld in de N-terminus van ultraperifere regio’s met een verkorte opeenvolging van rodopsine (Rho-tag) en een verbeterde oppervlakte expressie in menselijke embryonale nier (HEK) cellen¹³waargenomen. Voor de tag gekoppeld aan de volgorde van de OR aangebrachte wijzigingen is nog steeds een pad onderzocht voor het verbeteren van de OR expressie en functionaliteit^19,–²¹. Saito et al.. dan vervoer van receptor eiwitten 1 (RTP1) geïdentificeerd en RTP2 die vergemakkelijken OR mensenhandel. ²² een kortere versie van RTP1, genaamd RTP1S, is ook aangetoond dat zelfs effectiever dan de oorspronkelijke eiwit²³. De ontwikkeling van een cellijn (Hana3A) die stabiel G_{olf uitdrukt}, REEP1 en RTP1, RTP2 ²⁴, in combinatie met het gebruik van cyclisch adenosinemonofosfaat (cAMP) verslaggevers identificatie van odorant heeft ingeschakeld-OR interacties. Het mechanisme waarmee de RTP-familie van eiwitten cel oppervlakte expressie van ultraperifere regio’s bevordert moet nog worden bepaald.

Een waarschuwing voor deze gevestigde methoden is dat ze op de stimulatie van de odorant in vloeibare fase vertrouwen, wat betekent dat odorant vooraf in een medium stimulatie opgelost zijn en cellen stimuleren door vervanging van het medium. Dit is zeer verschillend van de fysiologische omstandigheden waar odorant moleculen de olfactorische epitheel in damp fase bereiken en activeren van ORs door ontbinding in de nasale mucosa. Als u wilt meer sterk gelijken op fysiologisch relevante stimulans blootstelling, Sanz et al.²⁰ voorgesteld een bepaling op basis van damp stimulatie door toepassing van een daling van odorant oplossing om op te hangen onder de binnenzijde van een plastic folie geplaatst op de top van cel wells. Zij de calcium antwoorden opgenomen door controle van de intensiteit van de fluorescentie. Deze methode was de eerste die lucht-fase odorant stimulatie, maar deed het niet toestaan dat een grote screening van OR activering.

Hier, ontwikkelden we een nieuwe methode waarmee real-time bewaking van in vitro OR activering via damp fase odorant stimulatie door de bepaling van de Glosensor (Figuur 1). Deze bepaling heeft eerder is gebruikt in het kader van vloeibare odorant stimulatie^{18,19,25,26,27,28,29, 30 , 31}. de controle kamer van de luminometer is eerste geëquilibreerd met gevaporiseerde odorant vóór plaat lezen(Figuur 1). Odorant moleculen zijn dan solvated in de buffer, Baden van Hana3A cellen, uiting geven aan de OR van belang, RTP1S en de Glosensor eiwitten (Figuur 1B). Als de odorant een agonist van de UPR’s is, zal de OR overschakelen naar een geactiveerde bevleesdheid en binden de G_olf, activeren de adenylyl cyclase (AC) en uiteindelijk leiden tot cAMP niveaus te stijgen. Dit stijgende kamp zal binden aan en activeer het eiwit Glosensor voor het genereren van luminescentie luciferine katalyseren. Deze luminescentie wordt vervolgens geregistreerd door de luminometer en kan OR activering. Deze methode is van groot belang in het kader van OR deorphanization, zoals het in vitro systemen dichter bij de natuurlijke waarneming van geuren brengt.

Protocol

1. Hana3A cellen cultuur Bereiden M10 (Minimum essentiële Medium (MEM) plus 10% v/v foetale runderserum (FBS)) en M10PSF (M10 plus 100 µg/mL penicilline-streptomycine en 1,25 µg/mL amfotericine B). Cultuur van de cellen in 10 mL van de M10PSF in een 100 mm cel cultuur schotel in een incubator vastgesteld op 37 ° C en 5% kooldioxide (CO2). Verdeel de cellen om de 2 dagen op een 20%-verhouding: bij 100% samenvloeiing van cellen (ongeveer 1.1 x 107 cellen) wordt waarge…

Representative Results

Wij onderzocht de reactie van drie muis ORs, Olfr746, Olfr124 en Olfr1093 met behulp van cinnamaldehyde damp stimulatie (Figuur 3). Gelijktijdig, gebruikten we een lege vectorbestrijding (Rho-pCI) om te verzekeren dat de activiteiten van odorant-geïnduceerde van de geteste ultraperifere regio’s specifieke (Figuur 3A). De real-time activering van de ultraperifere regio’s op damp odorant stimulans was gecontroleerde meer dan 20 meting cycli. De g…

Discussion

De perceptie van geur is fundamenteel afhankelijk van de activering van ultraperifere regio’s. Bijgevolg, begrip van hun functionaliteit is vereist voor spleet naar de complexe mechanismen waarmee de hersenen zijn vluchtige chemische omgeving waarnemen. Echter heeft het begrip van dit proces belemmerd door de moeilijkheden bij het vaststellen van een robuuste methode om het scherm van het repertoire van de OR voor functionaliteit tegen odorant in vitro. Cel oppervlak en heterologe expressie van ultraperifere reg…

Materials

0.05 % trypsin-EDTA	Gibco	25300-054	0.05% Trypsin – EDTA (1x), phenol red – store at 4°C
100 mm cell culture dish	BD Falcon	353003	100 mm x 20 mm cell culture dish
15 mL tube	BD Falcon	352099	17 mm x 120 mm conical tubes
96-well plate	Corning	3843	96 well, with LE lid white with clear bottom Poly-D-lysine coated Polystyrene
Amphotericin	Gibco	15290-018	Amphotericin B 250 µg/mL – store at 4°C
centrifuge machine	Jouan	C312	Centrifuge machine with swinging bucket rotor for 15 mL
Class II Type A/B3 fumehood	NUAIRE	NU-407-500	fumehood for cell culturing
FBS	Gibco	16000-044	Fetal Bovine Serum – store at -20°C
GloSensor cAMP Reagent	Promega	E1290	GloSensor cAMP Reagent luminescent protein substrate – store at -20°C
Incubator 37 °C; 5 % CO2	Fisher Scientific	11-676-604	Incubator for cell culturing
Lipofectamine 2000 reagent	Invitrogen	11668-019	Lipofectamine 2000 Reagent 1mg/ml transfection reagent – store at 4°C
Luminometer POLARstar OPTIMA	BMG LABTECH	discontinued	96 well plate reader for luminescence
Mineral oil	Sigma	M8410	Solvent for odorants – store at room temperature
Minimum Essential Medium (MEM)	Corning cellgro	10-010-CV	Minimum Essential Medium Eagle with Earle’s salts & L-glutamine – store at 4°C
Penicillin/Streptomycin	Sigma Aldrich	P4333	Penicillin-Streptomycin solution stabilized with 10,000 U of penicillin and 10 mg streptomycin – store at -20°C
pGlosensor	Promega	E2301	pGloSensor-22F cAMP luminescent protein plasmid – store at 4°C
phase contrast microscope	Leica	090-131.001	phase contrast microscope with x4, x10, x20 objectives
RTP1S	H. Matsunami lab	–	100 ng/µL plasmid – store at 4°C