In-vitro-Überwachung der Duftstoff-Rezeptor-Aktivierung durch einen Geruchsstoff in der Dampfphase in Echtzeit

Summary

Physiologisch werden durch Geruchsstoff Moleküle in der Dampfphase eingeatmet Geruchsstoff Rezeptoren aktiviert. Jedoch verwenden die meisten in-vitro-Systeme Flüssigphase Geruchsstoff Stimulation. Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode, die erlaubt, in-vitro-Echtzeitüberwachung der Duftstoff-Rezeptor-Aktivierung bei Geruchsstoff Stimulation in der Dampfphase.

Abstract

Olfaktorischen Wahrnehmung beginnt mit dem Zusammenspiel von Riechstoffen mit Duftstoff-Rezeptoren (oder) durch olfaktorischen sensorischen Neuronen (OSN) ausgedrückt. Geruch-Anerkennung folgt eine kombinatorische Codierschema, wo ein OR kann durch eine Reihe von Geruchsstoffen aktiviert werden und ein Geruchsstoff kann eine Kombination von Regionen in äußerster Randlage zu aktivieren. Organismen können durch solche kombinatorische Codierung erkennen und unterscheiden können zwischen einer Vielzahl von flüchtigen Geruchsmoleküle. So kann ein Geruch in einer bestimmten Konzentration beschrieben werden durch ein Aktivierungsmuster von Regionen in äußerster Randlage, die ist spezifisch für jeden Geruch. In diesem Sinne knacken die Mechanismen, die das Gehirn benutzt, um Geruch erfordert Verständnis Geruchsstoff wahrnehmen-OR-Interaktionen. Deshalb die Geruchssinn Gemeinschaft verpflichtet “diese Rezeptoren de-orphanize” ist. Konventionellen in-vitro-Systeme zur Identifizierung von Duftstoff- oder Wechselwirkungen verwendet haben Inkubation Zelle Medien mit Duftstoff, die unterscheidet sich von der natürlichen Erkennung von Gerüchen über Dampf Geruchsstoffe Auflösung in Nasenschleimhaut vor Interaktion mit ORs. Hier beschreiben wir eine neue Methode, die ermöglicht die Echtzeitüberwachung der OR-Aktivierung per Dampfphase Geruchsstoffe. Unsere Methode basiert auf Messung cAMP Freigabe durch Lumineszenz unter Verwendung der Glosensor-Assay. Es überbrückt Lücken zwischen in vivo und in-vitro-Ansätzen und bildet die Grundlage für eine biomimetische flüchtiger chemischer Sensor.

Introduction

Der Geruchssinn ermöglicht terrestrischen Tieren interagieren mit ihren flüchtigen chemischen Umgebung Laufwerk Verhalten und Emotionen. Grundsätzlich beginnt die Geruch-Erkennung mit dem allerersten Zusammenspiel von Geruchsstoff Moleküle mit dem olfaktorischen System auf der Ebene der Geruchsstoff Rezeptoren (ORs)¹. Bei Säugetieren sind individuell olfaktorischen sensorischen Neuronen (Korrelationsmöglichkeiten) befindet sich in der olfaktorischen Epithel²Regionen in äußerster Randlage zum Ausdruck gebracht. Sie gehören zu den G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR) Familie und genauer auf die Rhodopsin-ähnliche Unterfamilie (auch als Klasse A). Regionen in äußerster Randlage paar mit der stimulierende G Protein G_Olf deren Aktivierung zu Lager Produktion, gefolgt von der Eröffnung der zyklische Nukleotid geschlossene Kanäle und die Erzeugung von Aktionspotentialen führt. Es wird angenommen, dass ein Geruch der Wahrnehmung stützt sich auf ein bestimmtes Muster von aktivierten ORs^3,4 und deshalb Geruch Anerkennung folgt eine kombinatorische Codierschema, wo ein OR kann durch eine Reihe von Geruchsstoffen aktiviert werden und ein Geruchsstoff aktivieren kann ein Kombination von Regionen in äußerster Randlage. Und durch solche kombinatorische Codierung wird postuliert, daß Organismen erkennen und unterscheiden können zwischen einer Vielzahl von flüchtigen Geruchsmoleküle. Ist einer der Schlüssel zum Verständnis, wie Gerüche wahrgenommen werden, zu verstehen wie und die Regionen in äußerster Randlage sind durch einen bestimmten Geruch aktiviert.

In einem Versuch, Geruchsstoff aufzuklären- oder Wechselwirkungen, in-vitro-funktionelle Untersuchungen eine wesentliche Rolle gespielt haben. Die Identifizierung der Agonist duftende Liganden für Waise ORs (OR de Orphanization) ist seit den letzten zwanzig Jahren durch den Einsatz von verschiedenen in-vitro-, ex-Vivo- und in-vivo funktionelle Assays^{5,6,7 ein sehr aktives Feld ,8,9,10,11,12,13,14,15,16, 17}.

In-vitro-Test-Systeme eignen sich am besten für die detaillierte funktionelle Charakterisierung der Regionen in äußerster Randlage, einschließlich Ermittlung der Funktionsbereiche und kritische Rückstände von Regionen in äußerster Randlage sowie mögliche technische Anwendungen. Jedoch hat weitere wertvolle in-vitro-Systeme für Regionen in äußerster Randlage eine Herausforderung, im Teil wegen Schwierigkeiten mit der Kultivierung Korrelationsmöglichkeiten und funktionelle Expression von ORs in heterologen Zellen entwickelt. Die erste Herausforderung gewesen, Protokolle zu etablieren, die für die Zelle Oberflächenexpression von funktionalen ORs in der Zuordnung der Geruchsstoff erlaubt-OR-Interaktionen. Eine Reihe von unabhängigen Gruppen haben verschiedene Ansätze^{5,6,7,8,9,10,11,12genutzt, 14,18,19,20}. Eine der frühesten Errungenschaften wurde von Krautwurst Et Al. in der N-Terminus von Regionen in äußerster Randlage mit einem verkürzten Abfolge von Rhodopsin (Rho-Tag) markiert und eine verbesserte Oberflächenexpression in menschlichen embryonalen Niere (HEK) Zellen¹³beobachtet. Variationen gemacht, um den Tag angebracht, die OR-Sequenz ist immer noch ein Weg zur Verbesserung der OR Ausdruck und Funktionalität^19,21erkundet. Saito Et Al. dann Rezeptor-der Transport von Protein 1 (RTP1) identifiziert und RTP2 die OR Handel erleichtern. ²² eine kürzere Version des RTP1, genannt RTP1S, hat auch gezeigt, sogar wirksamer als die ursprüngliche Protein²³sein. Die Entwicklung einer Zelllinie (Hana3A), stabil G_Olfausdrückt, REEP1, RTP1 und RTP2 ²⁴, gepaart mit dem Einsatz der zyklischen Adenosin Monophosphate (cAMP) Reporter ermöglichte Identifizierung der Duftstoff-OR-Interaktionen. Der Mechanismus, durch die die RTP-Familie von Proteinen fördert die Zelle Oberflächenexpression von Regionen in äußerster Randlage bleibt bestimmt werden.

Ein Nachteil dieser etablierten Methoden ist, dass sie verlassen sich auf Geruchsstoff Stimulation in der flüssigen Phase, d.h. Geruchsstoffe werden vorab in einer Stimulation Medium aufgelöst und stimulieren Zellen durch das Medium zu ersetzen. Dies unterscheidet sich sehr von den physiologischen Bedingungen wo Geruchsstoff Moleküle erreichen das Riechepithel in der Dampfphase und ORs durch Auflösung in der Nasenschleimhaut zu aktivieren. Um mehr physiologisch relevanten Reiz Belichtung ähneln, schlug Sanz Et Al.²⁰ einen Assay basierend auf Dampf Stimulation durch die Anwendung eines Tropfen Duftstoff Lösung hängen unter der Innenfläche aus einer Kunststofffolie auf Zelle Brunnen gelegt. Sie nahmen die Kalzium-Reaktionen durch die Überwachung der Fluoreszenzintensität. Diese Methode war die erste Luft-Phase Geruchsstoff Stimulation verwenden, aber es war es nicht möglich eine große Vorführung der OR-Aktivierung.

Hier entwickelten wir eine neue Methode, die es ermöglicht Echtzeit-Überwachung von in-vitro-OR-Aktivierung über Dampf Phase Geruchsstoff Stimulation durch die Glosensor-Assay (Abbildung 1). Dieser Test hat früher im Zusammenhang mit der flüssigen Duftstoff Stimulation^{18,19,25,26,27,28,29, 30 , 31}. Überwachung Handelskammer die Luminometer ist zunächst equilibriert mit verdampftem Geruchsstoff vor der Platte lesen (Abb. 1A). Duftstoff-Moleküle sind dann solvatisierte in den Puffer, Baden Hana3A Zellen mit dem Ausdruck oder der Zinsen, RTP1S und die Glosensor Proteine (Abbildung 1B). Wenn der Geruchsstoff ein Agonist des OPS ist, wird OP wechseln Sie zu einer aktivierten Konformation G_Olf, Aktivierung der Adenylyl-Cyclase (AC) zu binden und letztlich dazu führen, dass cAMP Stufen zu steigen. Diese steigende Campingplätze zu binden und aktivieren das Glosensor Protein um Lumineszenz katalysieren Luciferin zu generieren. Diese Lumineszenz wird dann durch die Luminometer aufgezeichnet und OR Aktivierung Überwachung ermöglicht. Diese Methode ist von großem Interesse im Rahmen der OR Deorphanization, da es die natürliche Wahrnehmung von Gerüchen in-vitro-Systeme näher bringt.

Protocol

(1) Hana3A Zellen Kultur Bereiten Sie M10 (Minimum wesentliches Medium (MEM) zuzüglich 10 % V/V fetalen bovine Serum (FBS)) und M10PSF (M10 plus 100 µg/mL Penicillin-Streptomycin und 1,25 µg/mL Amphotericin B). Kulturzellen Sie in 10 mL M10PSF in der Kulturschale 100 mm Zelle in einem Inkubator bei 37 ° C und 5 % Kohlendioxid (CO2) festgelegt. Alle 2 Tage bei einem Verhältnis von 20 % der Zellen zu teilen: Wenn 100 % Zusammenfluss von Zellen (ca. 1,1 x 107 Zellen) …

Representative Results

Wir sehen die Reaktion der drei Maus ORs, Olfr746, Olfr124 und Olfr1093 mit Zimtaldehyd Dampf Stimulation (Abbildung 3). Gleichzeitig verwendet wir eine leere Vektorregelung (Rho-pCI) um sicherzustellen, dass die Duftstoff-induzierten Aktivitäten der getesteten Regionen in äußerster Randlage bestimmte waren(Abbildung 3). Die Echtzeit-Aktivierung der Regionen in äußerster Randlage auf Dampf Geruchsstoff Reiz war überwachten über 20 Messzyk…

Discussion

Die Wahrnehmung der Geruch ist wesentlich abhängig von der Aktivierung der Regionen in äußerster Randlage. Infolgedessen ist Verständnis ihrer Funktionalität erforderlich, um die komplexen Mechanismen, mit denen das Gehirn seine flüchtige chemische Umgebung wahrnehmen zu knacken. Jedoch wurde das Verständnis dieses Prozesses durch die Schwierigkeiten bei der Einrichtung einer robusten Methode der OR-Repertoire für Funktionalität gegen Riechstoffe in-vitro-. auf dem Bildschirm behindert Zelle Oberfläche…

Materials

0.05 % trypsin-EDTA	Gibco	25300-054	0.05% Trypsin – EDTA (1x), phenol red – store at 4°C
100 mm cell culture dish	BD Falcon	353003	100 mm x 20 mm cell culture dish
15 mL tube	BD Falcon	352099	17 mm x 120 mm conical tubes
96-well plate	Corning	3843	96 well, with LE lid white with clear bottom Poly-D-lysine coated Polystyrene
Amphotericin	Gibco	15290-018	Amphotericin B 250 µg/mL – store at 4°C
centrifuge machine	Jouan	C312	Centrifuge machine with swinging bucket rotor for 15 mL
Class II Type A/B3 fumehood	NUAIRE	NU-407-500	fumehood for cell culturing
FBS	Gibco	16000-044	Fetal Bovine Serum – store at -20°C
GloSensor cAMP Reagent	Promega	E1290	GloSensor cAMP Reagent luminescent protein substrate – store at -20°C
Incubator 37 °C; 5 % CO2	Fisher Scientific	11-676-604	Incubator for cell culturing
Lipofectamine 2000 reagent	Invitrogen	11668-019	Lipofectamine 2000 Reagent 1mg/ml transfection reagent – store at 4°C
Luminometer POLARstar OPTIMA	BMG LABTECH	discontinued	96 well plate reader for luminescence
Mineral oil	Sigma	M8410	Solvent for odorants – store at room temperature
Minimum Essential Medium (MEM)	Corning cellgro	10-010-CV	Minimum Essential Medium Eagle with Earle’s salts & L-glutamine – store at 4°C
Penicillin/Streptomycin	Sigma Aldrich	P4333	Penicillin-Streptomycin solution stabilized with 10,000 U of penicillin and 10 mg streptomycin – store at -20°C
pGlosensor	Promega	E2301	pGloSensor-22F cAMP luminescent protein plasmid – store at 4°C
phase contrast microscope	Leica	090-131.001	phase contrast microscope with x4, x10, x20 objectives
RTP1S	H. Matsunami lab	–	100 ng/µL plasmid – store at 4°C