फिजिकली, ओडोरेंट रिसेप्टर्स ओडोरेंट भाप चरण में साँस अणुओं द्वारा सक्रिय कर रहे हैं । हालांकि, सबसे इन विट्रो सिस्टम तरल चरण ओडोरेंट उत्तेजना का उपयोग । यहां, हम एक तरीका है कि वास्तविक समय की अनुमति देता है ओडोरेंट रिसेप्टर सक्रियण के भाप चरण में गंधक उत्तेजना पर के विट्रो निगरानी वर्तमान ।
घ्राण प्रत्यक्षण गंना रिसेप्टर्स (या) घ्राण संवेदी ंयूरॉंस (osn) द्वारा व्यक्त के साथ गंध की बातचीत के साथ शुरू होता है । गंध मांयता एक मिश्रित योजना है, जहां एक या गंध का एक सेट द्वारा सक्रिय किया जा सकता है और एक odorants ओआरएस का एक संयोजन को सक्रिय कर सकते है इस प्रकार है । इस तरह के संयोजन के माध्यम से कोडिंग, जीवों का पता लगाने और एक अस्थिर गंध अणुओं के असंख्य के बीच भेदभाव कर सकते हैं । इस प्रकार, एक दिया एकाग्रता में एक गंध ओआरएस, जो प्रत्येक गंध के लिए विशिष्ट है की एक सक्रियण पैटर्न द्वारा वर्णित किया जा सकता है । इस अर्थ में, तंत्र है कि मस्तिष्क के लिए गंध का उपयोग करता है खुर समझ गंघंत या बातचीत की आवश्यकता है । यही कारण है कि घ्राण समुदाय “de-अनाथ ize” इन रिसेप्टर्स के लिए प्रतिबद्ध है । ओडोरेंट की पहचान करने के लिए उपयोग किए जाने वाले पारंपरिक इन विट्रो सिस्टम्स-या इंटरैक्शन का उपयोग गंधों के साथ इंक्यूबैटिंग सेल मीडिया द्वारा किया जाता है, जो ओआरएस के साथ बातचीत करने से पहले नाक mucosa में वाष्प गंध के माध्यम से odors की प्राकृतिक पहचान से अलग है । यहां, हम एक नई विधि का वर्णन है कि वास्तविक समय की निगरानी के लिए की अनुमति देता है या भाप चरण odorants के माध्यम से सक्रियण । हमारी विधि glosensor परख का उपयोग कर संदीप्ति द्वारा शिविर रिहाई को मापने पर निर्भर करता है । यह vivo में और इन विट्रो दृष्टिकोण के बीच वर्तमान अंतराल पुलों और एक biomimetic अस्थिर रासायनिक संवेदक के लिए एक आधार प्रदान करता है.
गंध की भावना स्थलीय जानवरों उनके अस्थिर रासायनिक वातावरण के साथ बातचीत करने के लिए व्यवहार और भावनाओं को ड्राइव करने की अनुमति देता है । मूल रूप से, गंध का पता लगाने की प्रक्रिया घ्राण प्रणाली के साथ ओडोरेंट अणुओं के बहुत पहले बातचीत के साथ शुरू होता है, गंधकारी रिसेप्टर्स (ओआरएस)1के स्तर पर । स्तनधारियों में, ओआरएस को व्यक्तिगत रूप से घ्राण उपकला2में स्थित घ्राण संवेदी न्यूरॉन्स (osns) में व्यक्त किया जाता है । वे जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर (GPCR) परिवार से संबंधित है और अधिक ठीक rhodopsin की तरह उप परिवार के लिए (भी कक्षा एक कहा जाता है) । उत्तेजक जी प्रोटीन जीओएलएफ के साथ ओआरएस जोड़ी जिसका सक्रियण शिविर उत्पादन की ओर जाता है और इसके बाद चक्रीय न्यूक्लियोटाइड gated चैनलों और कार्रवाई की क्षमता की पीढ़ी के उद्घाटन के द्वारा । यह स्वीकार किया जाता है कि एक गंध खतरे सक्रिय ओआरएस3,4 और इसलिए गंध मांयता के एक विशिष्ट पैटर्न पर निर्भर करता है एक मिश्रित योजना है, जहां एक या गंध का एक सेट और एक odorants सक्रिय कर सकते है द्वारा सक्रिय हो सकते है एक ओडोरेंट एक ओआरएस का संयोजन । और इस तरह के संयोजन के माध्यम से कोडन, यह माने है कि जीवों का पता लगाने और अस्थिर गंध अणुओं के असंख्य के बीच भेदभाव कर सकते हैं । कैसे odors माना जाता है समझने की चाबियां में से एक को समझने की कैसे और जो ओआरएस एक दिया गंध से सक्रिय हैं ।
ओडोरेंट-या बातचीत को स्पष्ट करने के प्रयास में, इन विट्रो कार्यात्मक assays हैं एक आवश्यक भूमिका निभाई है । अनाथ ओआरएस (या de-अनाथाization) के लिए एगोनिस्ट सुगंधित लिगन्डों की पहचान पिछले बीस वर्षों के लिए एक बहुत सक्रिय क्षेत्र रहा है, विभिंन इन विट्रो के उपयोग के माध्यम से, पूर्व vivo में और vivo में कार्यात्मक assays हैं,5,6,7 ,8,9,10,11,12,13,14,15,16, १७।
इन विट्रो परख प्रणालियों के लिए सबसे अच्छा ओआरएस का विस्तृत कार्यात्मक लक्षण वर्णन के लिए अनुकूल हैं, कार्यात्मक डोमेन और ओआरएस के महत्वपूर्ण अवशेषों की पहचान करने सहित, साथ ही साथ संभावित इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों । तथापि, ओआरएस के लिए मूल्यवान इन विट्रो प्रणालियों का आगे विकास एक चुनौती रहा है, जो कि विषमजात कोशिकाओं में ओएनएस की कृत् य और ओआरएस की कार्यात्मक अभिव्यक्ति के साथ कठिनाई के कारण हुआ है । पहली चुनौती प्रोटोकॉल है कि ओडोरेंट के मानचित्रण में कार्यात्मक ओआरएस की सतह अभिव्यक्ति या बातचीत के लिए अनुमति की स्थापना करने के लिए किया गया था । कई स्वतंत्र समूहों ने विभिन्न दृष्टिकोणों का उपयोग किया है5,6,7,8,9,10,11,12, 14,18,19,20। प्रारंभिक उपलब्धियों में से एक Krautwurst एट अल द्वारा बनाया गया था । में टैग की गईं एन-टर्मिनस रोडोप्सिन के एक छोटा अनुक्रम के साथ ओआरएस (Rho-tag) और मानव भ्रूणीय गुर्दा (HEK) कोशिकाओं में एक बेहतर सतह अभिव्यक्ति मनाया13. या अनुक्रम से अनुलग्न टैग में किए गए भिंनताएं अभी भी सुधार या अभिव्यक्ति और कार्यक्षमता के लिए पता लगाया गया पथ है19,21। उसके बाद रिसेप्टर की पहचान की-परिवहन प्रोटीन 1 (RTP1) और RTP2 जो सुविधा या अवैध व्यापार । 22 RTP1 का छोटा-सा वर्शन, जिसे RTP1S कहा जाता है, उसे मूल प्रोटीन की तुलना में और भी असरदारदिखाया गया है । एक कोशिका रेखा के विकास (Hana3A) जो stably जीओएलएफ, REEP1, RTP1, और 24RTP2 व्यक्त, चक्रीय adenosine मोनोफॉस्फेट (शिविर) संवाददाताओं के उपयोग के साथ युग्मित है गंदांत या बातचीत की पहचान सक्षम है । जिस तंत्र द्वारा आरटीपी प्रोटीन के परिवार को बढ़ावा देता है सेल सतह ओआरएस की अभिव्यक्ति का निर्धारण करने के लिए रहता है ।
इन स्थापित तरीकों की एक चेतावनी है कि वे तरल चरण में गंध उत्तेजना पर भरोसा करते हैं, जिसका अर्थ है कि गंध पूर्व एक उत्तेजना माध्यम में भंग कर रहे है और माध्यम की जगह से कोशिकाओं को उत्तेजित । यह शारीरिक स्थितियों से बहुत अलग है, जहां गंध अणुओं वाष्प चरण में घ्राण उपकला तक पहुँचने और नाक mucosa में विघटन द्वारा ओआरएस को सक्रिय । करने के लिए और अधिक बारीकी से समान फिजिकली प्रासंगिक उत्तेजना जोखिम, sanz एट अल20 का प्रस्ताव एक एक प्लास्टिक सेल वेल्स के शीर्ष पर रखा फिल्म के भीतर का चेहरा नीचे लटका गंधंत समाधान की एक बूंद लगाने से भाप उत्तेजना के आधार पर परख । वे फ्लोरोसेंस तीव्रता की निगरानी के द्वारा कैल्शियम प्रतिक्रियाओं दर्ज की गई । इस विधि पहले हवा चरण गंना उत्तेजना का उपयोग किया गया था, लेकिन यह एक बड़ी स्क्रीनिंग या सक्रियण की अनुमति नहीं थी ।
यहाँ, हम एक नया तरीका है कि सक्षम बनाता है वास्तविक समय निगरानी में विट्रो या सक्रियण के माध्यम से भाप चरण ओडोरेंट उत्तेजना Glosensor परख द्वारा विकसित (चित्रा 1). यह परख पहले तरल ओडोरेंट उत्तेजना के संदर्भ में इस्तेमाल किया गया है18,19,25,26,27,28,29, 30 , 31. luminometer की निगरानी चैंबर पहली थाली पढ़ने से पहले vaporized ओडोरेंट के साथ equilibrated है (चित्रा 1एक) । गंधी अणुओं तो बफर में विलायकयोजित रहे हैं, स्नान Hana3A कोशिकाओं को व्यक्त करने या ब्याज की, RTP1S और glosensor प्रोटीन (चित्रा 1बी). यदि गंदांत या के एक एगोनिस्ट है, या एक सक्रिय रचना को स्विच और बांध जीओएलएफ, adenylyl cyclase सक्रिय (एसी), और अंत में शिविर के स्तर को जंम के कारण । इस बढ़ती शिविर के लिए बाध्य और Glosensor प्रोटीन को सक्रिय करने के लिए ल्यूसिफिनो उत्प्रेरित करना होगा । यह संदीप्ति तब संदीप्ति द्वारा दर्ज की गई है और सक्षम बनाता है या सक्रियण निगरानी । इस विधि के संदर्भ में उच्च ब्याज की है या deorphanization के रूप में यह odors की प्राकृतिक धारणा के करीब विट्रो सिस्टम में लाता है ।
गंध की धारणा मूल रूप से ओआरएस के सक्रियण पर निर्भर है । नतीजतन, उनकी कार्यक्षमता की समझ के लिए जटिल तंत्र है कि मस्तिष्क को अपने अस्थिर रासायनिक पर्यावरण अनुभव का उपयोग दरार की आवश्यकता है । हालांकि, इस ?…
The authors have nothing to disclose.
यह काम NIH (DC014423 और DC016224) और रक्षा उंनत अनुसंधान परियोजना एजेंसी RealNose परियोजना से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया । YF सामरिक अंतरराष्ट्रीय नेटवर्क आगे बढ़ाने के लिए प्रतिभाशाली शोधकर्ताओं (R2801) के संचलन में तेजी लाने के लिए JSPS कार्यक्रम से वित्तीय सहायता के साथ ड्यूक विश्वविद्यालय में रहे । हम सहर कलीम को पांडुलिपि के संपादन के लिए धन्यवाद देते हैं ।
0.05 % trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | 0.05% Trypsin – EDTA (1x), phenol red – store at 4°C |
100 mm cell culture dish | BD Falcon | 353003 | 100 mm x 20 mm cell culture dish |
15 mL tube | BD Falcon | 352099 | 17 mm x 120 mm conical tubes |
96-well plate | Corning | 3843 | 96 well, with LE lid white with clear bottom Poly-D-lysine coated Polystyrene |
Amphotericin | Gibco | 15290-018 | Amphotericin B 250 µg/mL – store at 4°C |
centrifuge machine | Jouan | C312 | Centrifuge machine with swinging bucket rotor for 15 mL |
Class II Type A/B3 fumehood | NUAIRE | NU-407-500 | fumehood for cell culturing |
FBS | Gibco | 16000-044 | Fetal Bovine Serum – store at -20°C |
GloSensor cAMP Reagent | Promega | E1290 | GloSensor cAMP Reagent luminescent protein substrate – store at -20°C |
Incubator 37 °C; 5 % CO2 | Fisher Scientific | 11-676-604 | Incubator for cell culturing |
Lipofectamine 2000 reagent | Invitrogen | 11668-019 | Lipofectamine 2000 Reagent 1mg/ml transfection reagent – store at 4°C |
Luminometer POLARstar OPTIMA | BMG LABTECH | discontinued | 96 well plate reader for luminescence |
Mineral oil | Sigma | M8410 | Solvent for odorants – store at room temperature |
Minimum Essential Medium (MEM) | Corning cellgro | 10-010-CV | Minimum Essential Medium Eagle with Earle’s salts & L-glutamine – store at 4°C |
Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | Penicillin-Streptomycin solution stabilized with 10,000 U of penicillin and 10 mg streptomycin – store at -20°C |
pGlosensor | Promega | E2301 | pGloSensor-22F cAMP luminescent protein plasmid – store at 4°C |
phase contrast microscope | Leica | 090-131.001 | phase contrast microscope with x4, x10, x20 objectives |
RTP1S | H. Matsunami lab | – | 100 ng/µL plasmid – store at 4°C |