Fysiologisk aktiveres odorant reseptorer av odorant molekyler inhalert i damp fase. Men benytter mest i vitro systemer flytende fase odorant stimulering. Her presenterer vi en metode som gjør at sanntid i vitro overvåking av odorant reseptor aktivisering på odorant stimulering i damp fase.
Olfactory oppfatning begynner med samspillet av odorants med odorant reseptorer (eller) uttrykt av olfactory sensoriske neurons (OSN). Lukt anerkjennelse følger en kombinasjon koding ordningen, der en eller kan aktiveres ved et sett med odorants og én odorant kan aktivere en kombinasjon av ORs. Gjennom slike kombinasjon koding, kan organismer oppdage og diskriminere imellom en myriade av flyktige lukt molekyler. Dermed kan en lukt i en gitt konsentrasjon beskrives av en aktivisering mønster av ORs, som er spesifikk for hver lukt. I den forstand, sprengning mekanismer som hjernen bruker oppfatter lukt krever forståelse odorant-OR interaksjoner. Det er derfor luktesans samfunnet er forpliktet til “de-orphanize” disse reseptorene. Konvensjonelle i vitro systemer brukes til å identifisere odorant- eller interaksjoner har utnyttet rugende cellen media med odorant, som er forskjellig fra naturlige påvisning av lukt via damp odorants oppløsning i nasal mucosa før samarbeidsstil ORs. Her beskriver vi en ny metode som tillater sanntids overvåking av OR aktivisering via damp-faset odorants. Vår metode er avhengig av måle leiren utgivelsen av luminescence bruker Glosensor analysen. Det bygger gjeldende gapene mellom i vivo og in vitro tilnærminger og gir et grunnlag for en biomimetic flyktige kjemiske sensor.
Luktesans kan terrestriske dyr å samhandle med flyktige kjemiske miljøet å kjøre atferd og følelser. Fundamentalt, lukt søkeprosessen starter med første samspillet av odorant molekyler med olfactory system på nivået av odorant reseptorer (ORs)1. I pattedyr uttrykkes individuelt ORs i olfactory sensoriske neurons (OSNs) ligger i olfactory epitel2. De hører til G-protein kombinert reseptor (GPCR) familien og mer presist til rhodopsin-lignende sub familien (også kalt klasse A). ORs par med stimulerende G protein Golf som aktivering fører til leiren produksjon etterfulgt av åpningen av syklisk nukleotid gated kanaler og generering av handlingen potensialer. Det er akseptert som en odor percept er avhengig av et bestemt mønster i aktivert ORs3,4 og derfor lukt anerkjennelse følger en kombinasjon koding ordningen, der en eller kan aktiveres ved et sett med odorants og én odorant kan aktivere en kombinasjonen av ORs. Og gjennom slike kombinasjon koding, er det postulerte at organismer kan oppdage og diskriminere imellom en myriade av flyktige lukt molekyler. En av nøklene til å forstå hvordan lukt oppfattes er å forstå hvordan og som ORs aktiveres en gitt lukt.
Å belyse odorant- eller interaksjoner, in vitro funksjonelle analyser har spilt en viktig rolle. Identifikasjon av Agonistiske illeluktende ligander for frittstående ORs (OR de orphanization) har vært et svært aktivt felt i de siste tyve årene, ved hjelp av ulike i vitro, ex vivo og i vivo funksjonelle analyser5,6,7 ,8,9,10,11,12,13,14,15,16, 17.
In vitro analysen systemer er best egnet for detaljert funksjonelle karakterisering av ORs, inkludert identifisering det funksjonelle og kritisk rester av ORs, samt mulige tekniske programmer. Men har videre utvikling av verdifulle i vitro systemer for ORs vært en utfordring, delvis på grunn av problemer med dyrking OSNs og funksjonelle uttrykk for ORs i heterologous celler. Den første utfordringen var å etablere protokoller som tillatt til cellen overflaten uttrykk for funksjonell ORs i tilordningen av odorant-OR interaksjoner. Flere uavhengige grupper har utnyttet ulike tilnærminger5,6,7,8,9,10,11,12, 14,18,19,20. En av de tidligste prestasjonene ble gjort av Krautwurst et al. i merket N-terminus av ORs med en forkortet sekvens av rhodopsin (Rho-koden) og observert forbedret overflaten uttrykk i menneskelige embryonale nyre (HEK) celler13. Variasjoner gjort i koden knyttet til OR sekvensen er fortsatt en bane utforsket for å forbedre OR uttrykk og funksjonalitet19,21. Saito et al. deretter identifisert reseptor-transport protein 1 (RTP1) og RTP2 som letter OR menneskehandel. 22 en kortere versjon av RTP1, kalt RTP1S, har også vist å være enda mer effektiv enn den opprinnelige protein23. Utviklingen av en celle linje (Hana3A) som uttrykker stabilt Golf, REEP1, RTP1 og RTP2 24, kombinert med bruk av syklisk adenosin monofosfat (cAMP) journalister har aktivert identifikasjon av odorant-OR interaksjoner. Mekanismen som RTP familien av proteiner fremmer celle overflaten uttrykk for ORs gjenstår å fastsettes.
En påminnelse av disse etablerte metoder er at de er avhengige av odorant stimulering i flytende fase, betyr at odorants pre oppløst i en stimulering medium og stimulere celler ved å erstatte medium. Dette er svært forskjellig fra de fysiologiske forholdene der odorant molekyler nå olfactory epitel i damp fase og aktivere ORs ved oppløsningen til nasal mucosa. Slik nærmere fysiologisk relevante stimulans eksponering, Sanz et al.20 foreslått en analyse basert på damp stimulering ved å bruke en dråpe odorant løsning å henge under indre overfor en plastfilm på oversiden av cellen brønner. De spilte inn kalsium svar ved å overvåke fluorescens intensitet. Denne metoden var først til å bruke air-fase odorant stimulering, men det gjorde ikke tillate en stor screening av OR aktivisering.
Her utviklet vi en ny metode som gir sanntids overvåking av i vitro OR aktivisering via damp fasen odorant stimulering av Glosensor analysen (figur 1). Denne analysen er brukt tidligere i forbindelse med flytende odorant stimulering18,19,25,26,27,28,29, 30 , 31. overvåking chamber of the luminometer er første equilibrated med fordampede odorant før plate lese (figur 1A). Odorant molekyler er da solvated inn i bufferen, bading Hana3A celler uttrykke eller interesse, RTP1S og Glosensor proteiner (figur 1B). Hvis odorant er en Agonistiske av OR, vil eller bytte til en aktivert konformasjon binde Golf, aktivere adenylyl cyclase (AC) og til slutt føre til leiren nivåer å stige. Denne stigende leiren vil binde til og aktivere Glosensor protein for å generere luminescence utløse luciferin. Denne luminescence deretter spilles av på luminometer og gjør OR aktivisering overvåking. Denne metoden er av høy rente i sammenheng med OR deorphanization som det bringer i vitro systemer nærmere til naturlige oppfatning av lukt.
Oppfatningen av lukt er fundamentalt avhengig aktivering av ORs. Følgelig kreves forståelse av funksjonaliteten å sprekk de komplekse mekanismene som hjernen bruker oppfatter sin flyktige kjemisk miljø. Imidlertid har forståelse av denne prosessen vært hemmet av vanskelighetene med å etablere en robust metode til skjermen OR repertoaret funksjonalitet mot odorants i vitro. Celle overflaten og heterologous uttrykk for ORs har vært delvis løst ved etableringen av merket reseptorer13</sup…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra NIH (DC014423 og DC016224) og Defense Advanced Research Project Agency RealNose prosjektet. YF bodde ved Duke University med finansiell støtte fra JSP Program for fremme strategiske internasjonale nettverk å akselerere sirkulasjon av dyktige forskere (R2801). Vi takker Sahar Kaleem for redigering av manuskriptet.
0.05 % trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | 0.05% Trypsin – EDTA (1x), phenol red – store at 4°C |
100 mm cell culture dish | BD Falcon | 353003 | 100 mm x 20 mm cell culture dish |
15 mL tube | BD Falcon | 352099 | 17 mm x 120 mm conical tubes |
96-well plate | Corning | 3843 | 96 well, with LE lid white with clear bottom Poly-D-lysine coated Polystyrene |
Amphotericin | Gibco | 15290-018 | Amphotericin B 250 µg/mL – store at 4°C |
centrifuge machine | Jouan | C312 | Centrifuge machine with swinging bucket rotor for 15 mL |
Class II Type A/B3 fumehood | NUAIRE | NU-407-500 | fumehood for cell culturing |
FBS | Gibco | 16000-044 | Fetal Bovine Serum – store at -20°C |
GloSensor cAMP Reagent | Promega | E1290 | GloSensor cAMP Reagent luminescent protein substrate – store at -20°C |
Incubator 37 °C; 5 % CO2 | Fisher Scientific | 11-676-604 | Incubator for cell culturing |
Lipofectamine 2000 reagent | Invitrogen | 11668-019 | Lipofectamine 2000 Reagent 1mg/ml transfection reagent – store at 4°C |
Luminometer POLARstar OPTIMA | BMG LABTECH | discontinued | 96 well plate reader for luminescence |
Mineral oil | Sigma | M8410 | Solvent for odorants – store at room temperature |
Minimum Essential Medium (MEM) | Corning cellgro | 10-010-CV | Minimum Essential Medium Eagle with Earle’s salts & L-glutamine – store at 4°C |
Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | Penicillin-Streptomycin solution stabilized with 10,000 U of penicillin and 10 mg streptomycin – store at -20°C |
pGlosensor | Promega | E2301 | pGloSensor-22F cAMP luminescent protein plasmid – store at 4°C |
phase contrast microscope | Leica | 090-131.001 | phase contrast microscope with x4, x10, x20 objectives |
RTP1S | H. Matsunami lab | – | 100 ng/µL plasmid – store at 4°C |