Realtid i Vitro övervakning av luktreceptor aktivering av en Luktämnet i gasfasen

Summary

Fysiologiskt, som luktämnen receptorer aktiveras av luktämnet molekyler inandning i gasfasen. Men, mest in vitro-system använda flytande fas luktämnet stimulering. Här presenterar vi en metod som möjliggör realtidsövervakning av in vitro-av luktämnet receptor aktiveringen vid luktämnet stimulering i gasfasen.

Abstract

Olfactory uppfattning börjar med samspelet mellan odoranter med luktämnet receptorer (eller) uttryckt av lukt sensoriska neuroner (OSN). Lukt erkännande följer en kombinatoriska kodning, där en OR kan aktiveras av en uppsättning odoranter och en luktämnen kan aktivera en kombination av ORs. Genom sådana kombinatoriska kodning, kan organismer upptäcka och diskriminera en myriad av flyktiga lukt molekyler. En lukt vid en given koncentration kan således beskrivas av en aktivering mönster av ORs, som är specifika för varje lukt. I det avseendet knäcka de mekanismer som hjärnan använder för att uppfatta lukt kräver förståelse luktämnet-OR interaktioner. Det är därför olfaction gemenskapen har förbundit sig att ”de-orphanize” dessa receptorer. Konventionella in vitro-system används för att identifiera luktämnet- eller interaktioner har utnyttjat ruvande cell media med luktämnen, som är skild från naturlig detektion av lukter via vapor odoranter upplösning i nässlemhinnan före interagera med ORs. Här beskriver vi en ny metod som möjliggör realtidsövervakning av OR aktiveringen via gasfasen doftämnen. Vår metod bygger på mätning cAMP release av luminiscens med Glosensor analys. Det överbryggar nuvarande luckor mellan in vivo och in vitro-metoder och ger en grund för en biomimetiska flyktiga kemiska sensor.

Introduction

Luktsinnet kan landlevande djur att interagera med sin flyktiga kemiska miljö till drive beteenden och känslor. Fundamentalt, lukt upptäckt processen börjar med första växelverkan av luktämnet molekyler med luktsinnet, i nivå med luktämnet receptorer (ORs)¹. Hos däggdjur uttrycks ORs individuellt i lukt sensoriska nervceller (OSNs) ligger i luktepitel². De tillhör familjen G-protein kopplade receptorer (GPCR) och mer exakt till familjen rhodopsin-liknande sub (kallas även klass A). ORs par med den stimulerande G protein G_olf vars aktivering leder till cAMP produktion följt av öppnandet av cykliska nukleotid gated kanaler och generering av handlingspänningar. Det är accepterat att en lukt percept förlitar sig på ett visst mönster av aktiverade ORs^3,4 och lukt erkännande följer således en kombinatoriska kodning, där en OR kan aktiveras av en uppsättning odoranter och en luktämnen kan aktivera ett kombination av ORs. Och genom sådana kombinatoriska kodning, är det postulerade att organismer kan upptäcka och diskriminera en myriad av flyktiga lukt molekyler. En av nycklarna till att förstå hur lukter uppfattas är att förstå hur och som ORs aktiveras av en viss lukt.

I ett försök att belysa luktämnet- eller interaktioner, in vitro-funktionella analyser har spelat en viktig roll. Identifiering av agonist illaluktande ligander för föräldralös ORs (OR de orphanization) har varit ett mycket aktivt fält för de senaste tjugo åren, med hjälp av olika in vitro, ex vivo och Invivo funktionella analyser^{5,6,7 ,8,9,10,11,12,13,14,15,16, 17}.

In vitro test system är bäst lämpade för detaljerad funktionell karakterisering av ORs, inklusive att identifiera funktionella domäner och kritiska rester av ORs, liksom potentiella tekniska tillämpningar. Dock har ytterligare utveckling av värdefulla in vitro-system för ORs varit en utmaning, delvis på grund av svårigheter med odling OSNs och funktionella uttryck för ORs i heterologa celler. Den första utmaningen hade varit att upprätta protokoll som tillåts av cell surface uttryck för funktionella ORs i kartläggningen av luktämnet-OR interaktioner. Ett antal oberoende grupper har använt olika metoder^{5,6,7,8,9,10,11,12, 14,18,19,20}. En av de tidigaste landvinningar gjordes av Krautwurst et al. i märkta N-terminalen av ORs med en förkortad sekvens av rhodopsin (Rho-tag) och observerade ett förbättrad yta uttryck i mänskliga embryonala njurar (HEK) celler¹³. Ändringar i för fästade OR sekvensen är fortfarande en sökväg som utforskas för att förbättra OR uttryck och funktionalitet^19,21. Saito et al. sedan identifierat receptor-transporterar protein 1 (RTP1) och RTP2 som underlättar OR människohandel. ²² en kortare version av RTP1, kallas RTP1S, har också visat sig vara ännu effektivare än den ursprungliga protein²³. Utvecklingen av en cellinje (Hana3A) som stabilt uttrycker G_olf, REEP1, RTP1 och RTP2 ²⁴, tillsammans med användning av cykliskt adenosinmonofosfat (cAMP) reportrar har aktiverat identifiering av luktämnet-OR interaktioner. Mekanismen genom vilken familjen RTP av proteiner främjar cell surface uttryck för ORs återstår för att pröva.

En varning av dessa etablerade metoder är att de som är beroende av luktämnet stimulering i flytande fas, vilket innebär att odoranter löses före till en stimulering medium och stimulera celler genom att ersätta mediet. Detta skiljer sig mycket från de fysiologiska förhållanden där luktämnet molekyler nå luktepitel i gasfasen och aktivera ORs genom upplösning i nässlemhinnan. För att mer likna fysiologiskt relevanta stimulans exponering, Sanz et al.²⁰ föreslog ett test baserat på vapor stimulering genom att tillämpa en droppe luktämnet lösning att hänga under inre ansikte av en plastfilm som placeras på toppen av cell brunnar. De spelade in kalcium Svaren genom att övervaka fluorescensintensiteten. Denna metod var de första att använda air-fas luktämnet stimulering, men det tillät inte en stor genomgång av OR aktivering.

Här utvecklade vi en ny metod som möjliggör realtidsövervakning av in vitro-OR aktiveringen via vapor fas luktämnet stimulering av Glosensor analysen (figur 1). Denna analys har använts tidigare i samband med flytande luktämnet stimulering^{18,19,25,26,27,28,29, 30 , 31}. övervakning kammaren av luminometern är först jämviktas med förångade luktämnet innan plattan läsning (figur 1A). Luktämnet molekyler är sedan solvatiserade in i bufferten, bad Hana3A celler som uttrycker eller intresse, RTP1S och Glosensor proteiner (figur 1B). Om luktämnet är en agonist av eller, kommer att eller byta till en aktiverad konformation binda den G_olf, aktivera den viktreglerande cyclase (AC) och slutligen orsaka cAMP-nivåerna stiger. Detta stigande läger kommer att binda till och aktivera det Glosensor proteinet för att generera luminiscens katalysera luciferin. Detta luminiscens registreras sedan av luminometern och möjliggör OR aktiveringen övervakning. Denna metod är av stort intresse i samband med OR deorphanization det leder in vitro-system närmare till naturliga uppfattningen av lukter.

Protocol

1. Hana3A celler kultur Förbereda M10 (minst viktigt Medium (MEM) plus 10% v/v fetalt bovint serum (FBS)) och M10PSF (M10 plus 100 µg/mL penicillin-streptomycin och 1,25 µg/mL amfotericin B). Odla cellerna i 10 mL M10PSF i en 100 mm cell kultur maträtt i en inkubator inställd på 37 ° C och 5% koldioxid (CO2). Dela upp cellerna varannan dag i förhållandet 20%: när 100% sammanflödet av celler (cirka 1,1 x 107 celler) observeras under en faskontrastmikroskop, as…

Representative Results

Vi tre mus ORs, Olfr746, Olfr124 och Olfr1093 svar använda kanelaldehyd vapor stimulering (figur 3). Samtidigt, vi använde en tom vector kontroll (Rho-pCI) för att säkerställa att de testade ORs luktämnet-inducerad verksamhet var specifika (figur 3A). Realtid aktiveringen av de yttersta randområdena vid vapor luktämnen stimulanspaket var övervakade över 20 mätning cykler. Data för varje var väl först normaliserade till Tom vektor i…

Discussion

Uppfattningen av lukt är grunden beroende av aktiveringen av ORs. Följaktligen krävs förståelse för deras funktionalitet att knäcka de komplexa mekanismer som hjärnan använder för att uppfatta dess flyktiga kemiska miljö. Dock har förståelse för denna process hämmats av svårigheterna att fastställa en robust metod skärm OR repertoaren för funktionalitet mot odoranter in vitro-. Cell surface och heterologa uttryck för ORs har delvis lösts genom skapandet av märkta receptorer<sup class="xref"…

Materials

0.05 % trypsin-EDTA	Gibco	25300-054	0.05% Trypsin – EDTA (1x), phenol red – store at 4°C
100 mm cell culture dish	BD Falcon	353003	100 mm x 20 mm cell culture dish
15 mL tube	BD Falcon	352099	17 mm x 120 mm conical tubes
96-well plate	Corning	3843	96 well, with LE lid white with clear bottom Poly-D-lysine coated Polystyrene
Amphotericin	Gibco	15290-018	Amphotericin B 250 µg/mL – store at 4°C
centrifuge machine	Jouan	C312	Centrifuge machine with swinging bucket rotor for 15 mL
Class II Type A/B3 fumehood	NUAIRE	NU-407-500	fumehood for cell culturing
FBS	Gibco	16000-044	Fetal Bovine Serum – store at -20°C
GloSensor cAMP Reagent	Promega	E1290	GloSensor cAMP Reagent luminescent protein substrate – store at -20°C
Incubator 37 °C; 5 % CO2	Fisher Scientific	11-676-604	Incubator for cell culturing
Lipofectamine 2000 reagent	Invitrogen	11668-019	Lipofectamine 2000 Reagent 1mg/ml transfection reagent – store at 4°C
Luminometer POLARstar OPTIMA	BMG LABTECH	discontinued	96 well plate reader for luminescence
Mineral oil	Sigma	M8410	Solvent for odorants – store at room temperature
Minimum Essential Medium (MEM)	Corning cellgro	10-010-CV	Minimum Essential Medium Eagle with Earle’s salts & L-glutamine – store at 4°C
Penicillin/Streptomycin	Sigma Aldrich	P4333	Penicillin-Streptomycin solution stabilized with 10,000 U of penicillin and 10 mg streptomycin – store at -20°C
pGlosensor	Promega	E2301	pGloSensor-22F cAMP luminescent protein plasmid – store at 4°C
phase contrast microscope	Leica	090-131.001	phase contrast microscope with x4, x10, x20 objectives
RTP1S	H. Matsunami lab	–	100 ng/µL plasmid – store at 4°C