Snabb generering av primär murina melanocyte och fibroblast kulturer
Summary
Detta protokoll beskriver en snabb metod för att samtidigt generera melanocyte och fibroblast kulturer från huden på 0-4 dag gamla möss. Dessa primära kulturer kan underhållas och manipuleras in vitro för att studera en mängd fysiologiskt relevanta processer, inklusive hud cellbiologi, pigmentering, sårläkning och melanom.
Abstract
Defekter i fibroblast eller melanocyte funktion är förknippade med hudsjukdomar, inklusive dålig barriärfunktion, defekt sårläkning, pigmentering defekter och cancer. Avgörande för förståelsen och förbättringen av dessa sjukdomar är experiment i primär fibroblast och melanocyte kulturer. Icke desto mindre, nuvarande protokoll för melanocyte isolering kräver att epidermal och dermal lagren av huden trypsinized och manuellt disassociated. Denna process är tidskrävande, tekniskt utmanande och bidrar till inkonsekvent avkastning. Dessutom, metoder för att samtidigt generera ren fibroblast kulturer från samma vävnadsprov är inte lätt tillgängliga. Här beskriver vi ett förbättrat protokoll för att isolera melanocyter och fibroblaster från huden på möss på postnatala dagar 0-4. I detta protokoll, hela huden är mekaniskt homogeniseras med hjälp av en vävnad chopper och sedan kortfattat smält med kollagenase och trypsin. Cell populationer isoleras sedan genom selektiv plätering följt av G418 behandling. Detta förfarande resulterar i konsekvent melanocyt och fibroblast avkastning från en enda mus i mindre än 90 min. Detta protokoll är också lätt skalbart, vilket gör det möjligt för forskare att bearbeta stora kohorter av djur utan en betydande ökning av hands-on tid. Vi visar genom flödescytometriska bedömningar att kulturer etablerade med detta protokoll är mycket berikade för melanocyter eller fibroblaster.
Introduction
Däggdjurs skinn är ett flerskiktade organ som skyddar kroppen från främmande patogener och ultraviolett strålning (UVR). Huden spelar också en avgörande roll i homeostatiska processer såsom sårläkning, temperaturreglering och D-vitaminproduktion1,2,3. Däggdjurs skinn består av tre stora celltyper: melanocyter, fibroblaster och keratinocyter. Dessa celltyper befolkar olika lager av huden, med keratinocyter som utgör epidermis, fibroblaster bosatta i dermis och melanocyter lokalisera till epidermal-dermal korsning och hårsäckar4. Här, vi detalj en enkel procedur som möjliggör samtidig generering av primära melanocyte och fibroblast kulturer från murina hud.
Melanocyter är pigment-producerande celler som finns på många platser i hela människokroppen, inklusive basal epidermis, iris, cochlea, hjärna och hårsäckar5. Den primära funktionen av melanocyter är att generera och utsöndra melanin-innehållande blåsor som kallas melanosomer5,6. Melanosomes innehåller två stora klasser av melanin: brun/svart eumelanin och gul/röd Pheomelanin6,7. Biokemiska processer inom melanocyten reglera den relativa överflöd av varje melanin arter och hjälpa till att bestämma hår, hud och ögonfärg8,9. Melanin tjänar också till att absorbera UVR och skydda solexponerade vävnader från mutagenes10.
Melanocyte dysfunktion kan orsaka pigmentdefekter och öka hudcancer känslighet. Till exempel, den hyperpigmenterade hud fläckar karakteristiska för melasma är resultatet av fokal melanin överproduktion, medan köns cells genetiska mutationer som kompromiss gener inblandade i melanin syntes leda till albinism11,12 . Intim kunskap om melanocytbiologi krävs för att utveckla strategier som kommer att korrigera sådana pigment defekter och i slutändan förbättra den psykosociala välbefinnande hos individer som drabbats av dessa sjukdomar. Underskott i melaninproduktionen och/eller förmåns syntesen av Pheomelanin är också förknippade med ökad hudcancer risk10. Denna risk tros bero på reducerat UVR-skydd6,13. Sålunda, metoder för att förbättra eller återställa eumelanin produktion i melanocyter kan minska förekomsten av hudcancer i dessa populationer.
Mesenkymala fibroblaster fastställa bindväv och strukturellt stöd för alla organ i kroppen, inklusive dermal lagret av huden14. Utsöndring av proteiner som kollagen, elastin, laminin och Fibronektin gör det möjligt för fibroblaster att bilda den extracellulära matrisen (ECM) som är nödvändig för vävnadens integritet1,14. Fibroblaster spelar också viktiga roller i processer såsom sårläkning, inflammation, angiogenes och cancer bildning/progression1,15,16.
Liknar melanocyter, defekter i fibroblast aktivering och funktion kan främja tumorigenes och sjukdom. Till exempel, olämplig fibroblast aktivering leder ofta till bildandet av fibros, till följd av den förbättrade deposition av överskott ECM komponenter i den omgivande vävnaden. Eftersom fibroblaster upprätthåller mycket av kroppens strukturella integritet, främjar fibros sjukdomar som påverkar många vävnader och organ, inklusive idiopatisk lungfibros, systemisk skleros, levercirros och hjärtfibros15. Fibroblaster spelar också en kritisk roll i cancer16. Cancer associerade fibroblaster (CAFs) är de vanligast förekommande icke-maligna celler i mikromiljön av många tumörer. CAFs har visat sig främja tumörproliferation, progression och terapeutiskt motstånd genom att modulera vävnad stelhet, lokal cytokin produktion och immunförsvaret16.
Primära cellkulturer ger forskare med genetiskt tractable modeller för att identifiera och mildra melanocyte och fibroblast defekter som leder till sjukdom. Men nuvarande metoder för att etablera melanocytkulturer är tidskrävande och tekniskt utmanande. Behovet av trypsinization och delikat separation av epidermis och dermis bidrar till variationer i experimentell avkastning och gör det svårt att utföra storskaliga experiment. Dessutom, protokoll för att samtidigt isolera melanocyter och fibroblaster från hela huden saknas för närvarande i området.
Vi har utvecklat en metod för att minska bearbetningssteg, variation och tid som krävs för att etablera melanocyte och fibroblastkulturer från samma hela hudprov. Med hjälp av en mekanisk homogenisering metod följt av en kort matsmältning, vår strategi minskar avsevärt mängden hands-on tid som krävs för att isolera primära melanocyter samtidigt möjliggöra samtidig fibroblast isolering. Den ökade hastigheten, effektiviteten och konsekvensen i detta protokoll, i kombination med förmågan att isolera melanocyter från 0-4 dagar gamla möss, ger forskarna flexibiliteten att utföra ett bredare spektrum av experiment än vad som tidigare varit möjligt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den in vitro-kulturen av primära melanocyter och fibroblaster har lett till betydande framsteg i vår förståelse av hudbiologi och sjukdom. Detta protokoll förbättrar på tidigare melanocyte isoleringsmetoder genom att minska den tid och tekniska kunniga som behövs för att generera konsekventa melanocyte kulturer samtidigt som den möjliggör samtidig isolering av hud fibroblaster. En roman, tidsbesparande inslag i detta förfarande är att dermis och epidermis inte behöver separeras. Istället, hudceller isolera…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar Damon Runyon Foundation (Innovation Award #38-16 till C.E.B.) och Pelotonia (B.M.M.) för ekonomiskt stöd. Vi är tacksamma mot C. Haines och C. Wormsbaecher som lämnat synpunkter för att förbättra manuskriptet texten. Detta arbete dragit nytta från Ohio State Comprehensive Cancer Centers analytiska cytometry delad resurs som stöds av NIH P30 CA016058.
Materials
| 0.2 µm PES sterile syringe filter | VWR | 28145-501 | |
| 10 cm cell culture dish | Corning | 430167 | |
| 40 µm cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 5 mL polystyrene round-bottom tubes | Fisher Scientific | 352008 | |
| 6-well cell culture dish | Sigma-Aldrich | SIAL0516 | |
| 70 µm cell strainer | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x) | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP9706-100 | |
| CF 488A Mix-n-Stain Antibody Labeling Kit | Biotium | 92273 | |
| CF 555 Mix-n-Stain Antibody Labeling Kit | Biotium | 92274 | |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Collagen from rat tail | Sigma-Aldrich | C7661 | |
| Collagenase Type I | Worthington Biochemicals | LS004156 | |
| Corning Penicillin/Streptomycin Solution | Fisher Scientific | 30-002-CL | |
| Cytokeratin 14 Antibody Alexa Fluor 647 | Novus Biologicals | NBP2-34403AF647 | |
| Deoxyribonuclease I | Worthington Biochemicals | LS002058 | |
| Di-butyryl cyclic AMP | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 12800-082 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermo Fisher | 65-0865-14 | |
| Ethanol, 200 proof | Fisher Scientific | 22032601 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12306C | |
| FSP1/S100A4 antibody | Millipore Sigma | 07-2274 | |
| G418 Disulfide | P212121 | LGB-418-1 | |
| Glacial Acetic Acid | VWR | VWRV0714 | |
| Horse Serum | Fisher Scientific | 26050088 | |
| HyClone L-Glutamine | Fisher Scientific | SH3003402 | |
| McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella | 10180 | |
| Melanoma gp100 antibody | Abcam | ab137078 | |
| Nutrient Mix F-12 Ham's Media | Sigma-Aldrich | N6760 | |
| Phorbol 12-Myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| Pierce 16% Formaldehyde | Thermo Fisher | 28908 | |
| Porcine Trypsin | Sigma-Aldrich | 85450C | |
| RPMI 1640 media | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | S-7900 | |
| Tissue Chopper Blade | Ted Pella | 121-6 | |
| Tissue Chopper Plastic Disk | Ted Pella | 10180-01 | |
| Trypsin | VWR | VWRL0154-0100 |
Referências
- Rittie, L. Cellular mechanisms of skin repair in humans and other mammals. Journal of Cell Communucation and Signal. 10 (2), 103-120 (2016).
- Romanovsky, A. A. Skin temperature: its role in thermoregulation. Acta Physiologica (Oxf). 210 (3), 498-507 (2014).
- Holick, M. F., Smith, E., Pincus, S. Skin as the site of vitamin D synthesis and target tissue for 1,25-dihydroxyvitamin D3. Use of calcitriol (1,25-dihydroxyvitamin D3) for treatment of psoriasis. Archives of Dermatology. 123 (12), 1677-1683 (1987).
- Yamaguchi, Y., Hearing, V. J. Physiological factors that regulate skin pigmentation. Biofactors. 35 (2), 193-199 (2009).
- Yamaguchi, Y., Hearing, V. J. Melanocytes and their diseases. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (5), (2014).
- Brenner, M., Hearing, V. J. The protective role of melanin against UV damage in human skin. Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 539-549 (2008).
- Thody, A. J., et al. Pheomelanin as well as eumelanin is present in human epidermis. The Journal of Investigative Dermatology. 97 (2), 340-344 (1991).
- Swope, V. B., Abdel-Malek, Z. A. MC1R: Front and Center in the Bright Side of Dark Eumelanin and DNA Repair. International Journal of Molecular Science. 19 (9), (2018).
- Barsh, G. S. What controls variation in human skin color. PLoS biology. 1 (1), 27 (2003).
- Abdel-Malek, Z., et al. The melanocortin-1 receptor is a key regulator of human cutaneous pigmentation. Pigment Cell Research. 13, 156-162 (2000).
- Gronskov, K., Ek, J., Brondum-Nielsen, K. Oculocutaneous albinism. Orphanet Journal of Rare Diseases. 2, 43 (2007).
- Kwon, S. H., Hwang, Y. J., Lee, S. K., Park, K. C. Heterogeneous Pathology of Melasma and Its Clinical Implications. International Journal of Molecular Sciences. 17 (6), (2016).
- D’Orazio, J., Jarrett, S., Amaro-Ortiz, A., Scott, T. UV radiation and the skin. International Journal of Molecular Science. 14 (6), 12222-12248 (2013).
- Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 786-801 (2014).
- Kendall, R. T., Feghali-Bostwick, C. A. Fibroblasts in fibrosis: novel roles and mediators. Frontiers in Pharmacology. 5, 123 (2014).
- Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nature Reviews Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).
- Dickson, M. A., et al. Human keratinocytes that express hTERT and also bypass a p16(INK4a)-enforced mechanism that limits life span become immortal yet retain normal growth and differentiation characteristics. Molecular and Cellular Biology. 20 (4), 1436-1447 (2000).
