Snelle aanmaak van primaire Murine melanocyten en fibroblast-culturen
Summary
Dit protocol schetst een snelle methode voor het gelijktijdig genereren van melanocyt en fibroblast culturen uit de huid van 0-4 dag oude muizen. Deze primaire culturen kunnen in vitro worden gehandhaafd en gemanipuleerd om een verscheidenheid aan fysiologisch relevante processen te bestuderen, waaronder huidcelbiologie, pigmentatie, wondgenezing en melanoom.
Abstract
Defecten in Fibroblast of melanocyten functie worden geassocieerd met huidziekten, waaronder een slechte barrièrefunctie, defecte wondgenezing, pigmentatie defecten en kanker. Essentieel voor het begrijpen en verbeteren van deze ziekten zijn experimenten in primaire fibroblast en melanocyten culturen. Niettemin vereisen de huidige protocollen voor melanocyten isolatie dat de epidermale en dermale lagen van de huid trypsinized zijn en handmatig worden ontsierd. Dit proces is tijdrovend, technisch uitdagend en draagt bij aan inconsistente opbrengsten. Bovendien zijn methoden voor het gelijktijdig genereren van zuivere fibroblast culturen uit hetzelfde weefselmonster niet direct beschikbaar. Hier beschrijven we een verbeterd protocol voor het isoleren van melanocyten en fibroblasten uit de huid van muizen op postnatale dagen 0-4. In dit protocol wordt de hele huid mechanisch gehomogeniseerd met behulp van een weefsel hakselaar en vervolgens kort verteerd met collagenase en trypsine. Celpopulaties worden vervolgens geïsoleerd door selectieve beplating gevolgd door G418 behandeling. Deze procedure resulteert in consistente melanocyt en fibroblast opbrengsten uit een enkele muis in minder dan 90 min. Dit protocol is ook gemakkelijk schaalbaar, waardoor onderzoekers grote cohorten van dieren kunnen verwerken zonder een aanzienlijke toename van de hands-on tijd. We tonen door flowcytometrische beoordelingen dat culturen die zijn vastgesteld met behulp van dit protocol zijn sterk verrijkt voor melanocyten of fibroblasten.
Introduction
De zoogdier huid is een meerlaagse orgel dat het lichaam beschermt tegen vreemde pathogenen en ultraviolet bestraling (UVR). De huid speelt ook een cruciale rol in homeostatische processen zoals wondgenezing, temperatuur regulering en vitamine D-productie1,2,3. Zoogdier huid bestaat uit drie belangrijke celtypen: melanocyten, fibroblasten en keratinocytes. Deze celtypen vullen verschillende lagen van de huid, met keratinocyten die de epidermis vormen, fibroblasten die zich in de dermis bevinden en melanocyten lokaliseren naar de epidermale-dermale kruising en haarfollikels4. Hier, we detail een eenvoudige procedure die de gelijktijdige generatie van primaire melanocyt en fibroblast culturen van Murine huid mogelijk maakt.
Melanocyten zijn pigment-producerende cellen gevonden op vele locaties in het menselijk lichaam, met inbegrip van de basale epidermis, Iris, cochlea, hersenen en haarfollikels5. De primaire functie van melanocyten is het genereren en afscheiden van melanoin bevattende blaasjes, de zogenaamde melanomen5,6. Melanosomes bevatten twee belangrijke klassen van Melin: bruin/zwart eumelline en geel/rood pheomelanin6,7. Biochemische processen binnen de melanocyten reguleren de relatieve abundantie van elke melendiersoort en helpen bij het bepalen van haar, huid en oogkleur8,9. Melin dient ook om UVR te absorberen en zonblootliggende weefsels te beschermen tegen mutagenese10.
Melanocyte dysfunctie kan pigmentaire defecten veroorzaken en de gevoeligheid van de huidkanker verhogen. De hypergepigmenteerde huidpleisters die kenmerkend zijn voor Melasma zijn bijvoorbeeld het resultaat van focale melinoverproductie, terwijl kiembaan genetische mutaties die genen die betrokken zijn bij melinsynthese, leiden tot albinisme11,12 . Intieme kennis van melanocyt biologie is nodig om strategieën te ontwikkelen die dergelijke pigmentaire gebreken corrigeren en uiteindelijk het psychosociale welzijn van individuen die met deze ziekten worden getroffen verbeteren. Tekorten in Melin productie en/of de preferentiële synthese van pheomelanin zijn ook geassocieerd met verhoogde huidkanker risico10. Dit risico wordt verondersteld te resulteren uit verminderde uvr-bescherming6,13. Daarom kunnen methoden voor het verbeteren of herstellen van de eumelanine-productie in melanocyten de incidentie van huidkanker in deze populaties verminderen.
Mesenchymale fibroblasten vestigen het bindweefsel en de structurele steun voor alle organen van het lichaam, inclusief de huidlaag van de huid14. Uitscheiding van eiwitten zoals collageen, elastine, laminine en fibronectin maken fibroblasten mogelijk om de extracellulaire matrix (ECM) te vormen die essentieel is voor weefsel integriteit1,14. Fibroblasten spelen ook essentiële rollen in processen zoals wondgenezing, ontsteking, angiogenese en kankervorming/progressie1,15,16.
Vergelijkbaar met melanocyten, defecten in fibroblast activering en functie kan tumorvorming en ziekte te bevorderen. Bijvoorbeeld, ongepaste fibroblast activering leidt vaak tot de vorming van fibrose, als gevolg van de verbeterde afzetting van overtollige ECM componenten in het omringende weefsel. Omdat fibroblasten een groot deel van de structurele integriteit van het lichaam behouden, bevordert fibrose ziekten die talrijke weefsels en organen treffen, waaronder idiopathische pulmonale fibrose, systemische sclerose, levercirrose en cardiale fibrose15. Fibroblasten spelen ook een cruciale rol in kanker16. Kanker geassocieerde fibroblasten (CAFs) zijn de meest voorkomende niet-maligne cellen in de micro omgeving van veel tumoren. CAFs is aangetoond dat het bevorderen van tumor proliferatie, progressie en therapeutische weerstand door modulerende weefsel stijfheid, lokale cytokine productie en immune functie16.
Primaire celculturen bieden onderzoekers met genetisch Tractable modellen om melanocyt en fibroblast defecten die tot ziekte leiden te identificeren en te verzachten. Echter, de huidige methoden voor het vaststellen van melanocyten culturen zijn tijdrovend en technisch uitdagend. De behoefte aan trypsinoisatie en delicate scheiding van de epidermis en dermis draagt bij aan de variabiliteit in de experimentele opbrengst en maakt het moeilijk om grootschalige experimenten uit te voeren. Bovendien, protocollen voor het gelijktijdig isoleren van melanocyten en fibroblasten uit de hele huid zijn momenteel ontbreekt in het veld.
We hebben een methode ontwikkeld om de verwerkingsstappen, variabiliteit en tijd te verminderen die nodig zijn om melanocyten en fibroblast-culturen van hetzelfde hele huid monster te maken. Met behulp van een mechanische homogenisatie methode, gevolgd door een korte spijsvertering, vermindert onze strategie de hoeveelheid hands-on tijd die nodig is om primaire melanocyten te isoleren, terwijl gelijktijdige fibroblast-isolatie mogelijk is. De toegenomen snelheid, efficiëntie en consistentie van dit protocol, in combinatie met de mogelijkheid om melanocyten te isoleren van 0-4 dag oude muizen, biedt onderzoekers de flexibiliteit om een breder scala aan experimenten uit te voeren dan voorheen mogelijk was.
Protocol
Representative Results
Discussion
De in vitro cultuur van primaire melanocyten en fibroblasten heeft geleid tot aanzienlijke vooruitgang in ons begrip van huid biologie en ziekte. Dit protocol verbetert de eerdere melanocyten isolatie methoden door het verminderen van de tijd en technische savvy die nodig zijn voor het genereren van consistente melanocyt culturen terwijl het gelijktijdige isolatie van de huid fibroblasten. Een nieuwe, tijdbesparende element van deze procedure is dat de dermis en de epidermis niet hoeven te worden gescheiden. In plaats da…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs danken de Damon Runyon Foundation (Innovation Award #38-C.E.B.) en Pelotonia (B.M.M.) voor financiële ondersteuning. We zijn dankbaar voor C. Haines en C. Wormsbaecher die opmerkingen hebben verstrekt om de tekst van het manuscript te verbeteren. Dit werk profiteerde van de Ohio State uitgebreide Cancer Center analytische Cytometry gedeelde resource die wordt ondersteund door NIH P30 CA016058.
Materials
| 0.2 µm PES sterile syringe filter | VWR | 28145-501 | |
| 10 cm cell culture dish | Corning | 430167 | |
| 40 µm cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 5 mL polystyrene round-bottom tubes | Fisher Scientific | 352008 | |
| 6-well cell culture dish | Sigma-Aldrich | SIAL0516 | |
| 70 µm cell strainer | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x) | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP9706-100 | |
| CF 488A Mix-n-Stain Antibody Labeling Kit | Biotium | 92273 | |
| CF 555 Mix-n-Stain Antibody Labeling Kit | Biotium | 92274 | |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Collagen from rat tail | Sigma-Aldrich | C7661 | |
| Collagenase Type I | Worthington Biochemicals | LS004156 | |
| Corning Penicillin/Streptomycin Solution | Fisher Scientific | 30-002-CL | |
| Cytokeratin 14 Antibody Alexa Fluor 647 | Novus Biologicals | NBP2-34403AF647 | |
| Deoxyribonuclease I | Worthington Biochemicals | LS002058 | |
| Di-butyryl cyclic AMP | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 12800-082 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermo Fisher | 65-0865-14 | |
| Ethanol, 200 proof | Fisher Scientific | 22032601 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12306C | |
| FSP1/S100A4 antibody | Millipore Sigma | 07-2274 | |
| G418 Disulfide | P212121 | LGB-418-1 | |
| Glacial Acetic Acid | VWR | VWRV0714 | |
| Horse Serum | Fisher Scientific | 26050088 | |
| HyClone L-Glutamine | Fisher Scientific | SH3003402 | |
| McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella | 10180 | |
| Melanoma gp100 antibody | Abcam | ab137078 | |
| Nutrient Mix F-12 Ham's Media | Sigma-Aldrich | N6760 | |
| Phorbol 12-Myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| Pierce 16% Formaldehyde | Thermo Fisher | 28908 | |
| Porcine Trypsin | Sigma-Aldrich | 85450C | |
| RPMI 1640 media | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | S-7900 | |
| Tissue Chopper Blade | Ted Pella | 121-6 | |
| Tissue Chopper Plastic Disk | Ted Pella | 10180-01 | |
| Trypsin | VWR | VWRL0154-0100 |
Referências
- Rittie, L. Cellular mechanisms of skin repair in humans and other mammals. Journal of Cell Communucation and Signal. 10 (2), 103-120 (2016).
- Romanovsky, A. A. Skin temperature: its role in thermoregulation. Acta Physiologica (Oxf). 210 (3), 498-507 (2014).
- Holick, M. F., Smith, E., Pincus, S. Skin as the site of vitamin D synthesis and target tissue for 1,25-dihydroxyvitamin D3. Use of calcitriol (1,25-dihydroxyvitamin D3) for treatment of psoriasis. Archives of Dermatology. 123 (12), 1677-1683 (1987).
- Yamaguchi, Y., Hearing, V. J. Physiological factors that regulate skin pigmentation. Biofactors. 35 (2), 193-199 (2009).
- Yamaguchi, Y., Hearing, V. J. Melanocytes and their diseases. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (5), (2014).
- Brenner, M., Hearing, V. J. The protective role of melanin against UV damage in human skin. Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 539-549 (2008).
- Thody, A. J., et al. Pheomelanin as well as eumelanin is present in human epidermis. The Journal of Investigative Dermatology. 97 (2), 340-344 (1991).
- Swope, V. B., Abdel-Malek, Z. A. MC1R: Front and Center in the Bright Side of Dark Eumelanin and DNA Repair. International Journal of Molecular Science. 19 (9), (2018).
- Barsh, G. S. What controls variation in human skin color. PLoS biology. 1 (1), 27 (2003).
- Abdel-Malek, Z., et al. The melanocortin-1 receptor is a key regulator of human cutaneous pigmentation. Pigment Cell Research. 13, 156-162 (2000).
- Gronskov, K., Ek, J., Brondum-Nielsen, K. Oculocutaneous albinism. Orphanet Journal of Rare Diseases. 2, 43 (2007).
- Kwon, S. H., Hwang, Y. J., Lee, S. K., Park, K. C. Heterogeneous Pathology of Melasma and Its Clinical Implications. International Journal of Molecular Sciences. 17 (6), (2016).
- D’Orazio, J., Jarrett, S., Amaro-Ortiz, A., Scott, T. UV radiation and the skin. International Journal of Molecular Science. 14 (6), 12222-12248 (2013).
- Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 786-801 (2014).
- Kendall, R. T., Feghali-Bostwick, C. A. Fibroblasts in fibrosis: novel roles and mediators. Frontiers in Pharmacology. 5, 123 (2014).
- Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nature Reviews Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).
- Dickson, M. A., et al. Human keratinocytes that express hTERT and also bypass a p16(INK4a)-enforced mechanism that limits life span become immortal yet retain normal growth and differentiation characteristics. Molecular and Cellular Biology. 20 (4), 1436-1447 (2000).
