En avansert murine modell for alkoholfrie steatohepatitis i samarbeid med type 2 diabetes
Summary
En enkel og pålitelig diett-indusert gnager dyr modell for alkoholfrie steatohepatitis (NASH) er beskrevet, oppnås gjennom ikke-SPF boliger av dyrene og administrasjon av en bestemt høy-fett diett. Vi beskriver identifisering av lever-og fett immunceller undergrupper for å recapitulate menneskelige immunologiske tilstander ved å utsette mus for miljø bakterier.
Abstract
Fedme er assosiert med kronisk lav-grade betennelse og insulinresistens, bidrar til en økende utbredelse av kroniske metabolske sykdommer, slik som type 2 diabetes og alkoholfrie steatohepatitis (NASH). Nyere forskning har fastslått at Pro-inflammatorisk immunceller infiltrere overvektige hypertrofisk fettvev og lever. Gitt den nye betydningen av immunceller i sammenheng med metabolske homeostase, er det et kritisk behov for å kvantifisere og karakterisere deres modifikasjon under utviklingen av type 2 diabetes og NASH. Imidlertid, dyr modeller det indusere patofysiologiske vise egenskaper typisk av Human NASH er sparsom.
I denne artikkelen gir vi en detaljert protokoll for å identifisere immun celle delsett isolert fra lever og fettvev i en pålitelig musemodell av NASH, etablert av boliger høy fett diett (HFD) mus under ikke-spesifikke patogen-fri (SPF) forhold uten barriere i minst sju uker. Vi viser håndtering av mus i ikke-SPF forhold, fordøyelse av vev og identifisering av makrofager, naturlig Killer (NK) celler, dendrittiske celler, B og T celle delsett av Flow flowcytometri. Representant flyt flowcytometri tomter fra SPF HFD mus og ikke-SPF mus er gitt. For å få pålitelige og interpretable data, bruk av antistoffer, nøyaktige og presise metoder for vev fordøyelse og riktig gating i flyt flowcytometri eksperimenter er kritiske elementer.
Intervensjonen for å gjenopprette fysiologisk antigen eksponering i mus ved å bolig dem i ikke-SPF forhold og løs eksponering for mikrobiell antigener kan gi et relevant verktøy for å undersøke sammenhengen mellom immunologiske endringer, diett-indusert fedme og relaterte langsiktige komplikasjoner.
Introduction
Fedme er en multifaktoriell lidelse og en stor risikofaktor for å utvikle hjertesykdom, hjerneslag, alkoholfritt steatohepatitis (NASH), type 2 diabetes (T2D) og noen typer kreft. Utbredelsen av fedme er raskt økende globalt. I dag, 2 100 000 000 mennesker-nesten 30% av verdens befolkning-er enten overvektige eller overvekt1. Fedme-assosiert insulinresistens kan føre til T2D, når oppbrukt bukspyttkjertel Holme beta celler ikke klarer å kompensere for økt behov for insulin for å opprettholde glukose homeostase2.
Fettvev består av ulike celletyper inkludert adipocytter, endothelial celler, fibroblaster og immunceller. Under progresjon av fedme, kan endringer i antall og aktivitet av immunceller føre til lav-grade betennelse i hypertrofisk fettvev3,4. Nærmere bestemt har det blitt funnet at overdreven energiinntak, ledsaget av kronisk forhøyede nivåer av blod glukose, triglyserider og frie fettsyrer, fører til adipocyte hypoksi, endoplasmatiske retikulum stress, nedsatt mitokondrie funksjon og forbedret cytokin sekresjon, noe som resulterer i aktivering av Pro-inflammatorisk fett immunceller5,6. Tidligere forskning har i hovedsak fokusert på medfødt immunitet, men mer nylig adaptive immunceller (T-og B-celler) har dukket opp som viktige regulatorer av glukose homeostase. De har inflammatoriske (inkludert CD8+ T celler, Th1, og B celler) eller primært regulatoriske funksjoner (inkludert regulatoriske T (treg) celler, Th2 celler) og kan både forverre eller beskytte mot insulinresistens7,8 , 9i.
Videre ble det foreslått flere mekanismer for å forklare hvordan Fedme øker steatohepatitis, inkludert økt produksjon av cytokiner av fettvev10. NASH, den progressive form av alkoholfrie fatty leversykdom og en stor helse byrde i utviklede land, er histologisk preget av ballong hepatocytter, lipid akkumulering, fibrose og pericellular betennelser og kan utvikle seg til skrumplever, sluttfasen leversykdom eller leverkreft. Flere diett (for eksempel metionin og kolin mangelfull diett11) er kjent for å indusere Nash-lignende leveren patologi i ikke-menneskelige dyr modeller, men de fleste av disse tilnærmingene ikke recapitulate menneskelige forhold av Nash og dens metabolske konsekvenser som de enten krever spesifikke gen knockout, ikke-fysiologiske kosttilskudd manipulasjoner eller mangel insulinresistens typisk for menneskelig NASH. Videre er vår forståelse av de underliggende mekanismene for metabolske sykdommer for tiden basert på eksperimenter utført med laboratoriet mus plassert under standard spesifikke patogen gratis (SPF) forhold. Disse barriere fasiliteter er unormalt hygienisk og ikke vurdere mikrobiell mangfold mennesker må møte, som kan gjøre rede for vanskeligheter i oversettelsesprosessen av dyrestudier til kliniske tilnærminger12,13 , 14i det.
For å undersøke de ulike immun celle undergrupper i fettvev og lever under utvikling av insulinresistens og NASH i en avansert mus modell reprodusere menneskelige immunologiske forhold, mus ble plassert i individuelle bur i semi sterile forhold uten barriere. Mus huset under antigen utsatte forhold utviklet NASH-like leveren patologi allerede etter 15 uker med høy fett diett (HFD) fôring13. Sammenlignet med alder-matchet SPF mus de utviklet macrovesicular steatosis, Hepatic infiltrasjon og aktivering av immunceller.
Dette manuskriptet beskriver en robust flyt flowcytometri analyse for å definere og telle immun celle undergrupper fra mus fettvev og lever i en modell av NASH. Flow flowcytometri analyse tillater påvisning av flere parametre for individuelle celler samtidig i motsetning til RT-PCR eller immunhistokjemi tilnærminger.
Oppsummert, vår studie tilbyr en musemodell av kortsiktige HFD for å undersøke utviklingen av insulinresistens og NASH og de underliggende mekanismene som også utstillinger troskap til den menneskelige tilstand.
Protocol
Representative Results
Discussion
Steatohepatitis har en sterk assosiasjon med metabolske unormalt som fedme, insulinresistens og dyslipidemi15. Flere studier tyder på at fettvev betennelse kan drive patogenesen av type 2 diabetes, inkludert endrede nivåer av celler av både medfødt og adaptive immunsystem4,5,16,17 . I tillegg har det blitt funnet at fedme modulerer aktiveringen av immun veier, som ka…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker anke Jurisch, Diana Woellner, Dr. Kathrin Witte og Cornelia Heckmann for hjelp med eksperimentelle prosedyrer og Benjamin Tiburzy fra Biolegend for nyttige kommentarer på gating strategi. JS ble støttet av Helmholtz Grant (ICEMED). Denne studien ble støttet av tilskudd fra klinisk forskning enhet av Berlin Institute of Health (BIH), den “BCRT-Grant” av det tyske føderale departementet for utdanning og forskning og Einstein Foundation. K.S.-B. og H.-D.V. er finansiert av FOR2165.
Materials
| 100µm cell strainers | Falcon | 352340 | |
| 1ml syringe | BD | 309659 | |
| 26G x 5/8 needles | BD | 305115 | |
| 35mm Petri Dishes | Falcon | 353001 | |
| 40µm cell strainers | Falcon | 352340 | |
| ACK lysis buffer | GIBCO | A1049201 | |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45 | Biolegend | 103127 | AB_493714 (BioLegend Cat. No. 103127) |
| Analysis software | FlowJo 10.0.8 software | ||
| APC anti-mouse CD11c Antibody | Biolegend | 117309 | AB_313778 (BioLegend Cat. No. 117309) |
| APC anti-mouse KLRG1 (MAFA) Antibody | Biolegend | 138411 | AB_10645509 (BioLegend Cat. No. 138411) |
| BV421 anti-mouse CD127 Antibody | Biolegend | 135023 | AB_10897948 (BioLegend Cat. No. 135023) |
| BV421 anti-mouse F4/80 Antibody | Biolegend | 123131 | AB_10901171 (BioLegend Cat. No. 123131) |
| BV605 anti-mouse CD279 (PD-1) Antibody | Biolegend | 135219 | AB_11125371 (BioLegend Cat. No. 135219) |
| BV605 anti-mouse NK-1.1 Antibody | Biolegend | 108739 | AB_2562273 (BioLegend Cat. No. 108739) |
| BV650 anti-mouse/human CD11b Antibody | Biolegend | 101239 | AB_11125575 (BioLegend Cat. No. 101239) |
| BV711 anti-mouse/human B220 Antibody | Biolegend | 103255 | AB_2563491 (BioLegend Cat. No. 103255) |
| BV785 anti-mouse CD8a Antibody | Biolegend | 100749 | AB_11218801 (BioLegend Cat. No. 100749) |
| C57Bl/6J mice, male, 5 weeks old | Forschungseinrichtungen für experimentelle Medizin (FEM) | ||
| CaCl2 | Charité – Universitätsmedizin Berlin | A119.1 | |
| Collagenase NB 4G Proved Grade | SERVA | 11427513 | |
| Collagenase Typ I | Worthington | LS004197 | |
| Conical centrifuge tube 15ml | Falcon | 352096 | |
| Conical centrifuge tube 50ml | Falcon | 352070 | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | 4716728001 | |
| Fetal bovine serum | Biochrom | S0115 | |
| Filter 30µm | Celltrics | 400422316 | |
| FITC anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100203 | AB_312660 (BioLegend Cat. No. 100203) |
| Flow cytometry | BD-LSR Fortessa | ||
| Forceps | Sigma-Aldrich | F4142-1EA | |
| HBSS | Bioanalytic GmBH | 085021-0500 | |
| High-fat diet | SSNIF | E15741–34 | 60 kJ% from fat, 19 kJ% from proteins, and 21 kJ% from carbohydrates |
| micro dissecting scissors | Sigma-Aldrich | S3146 | used for dissection purposes |
| PE anti-mouse CD25 Antibody | Biolegend | 101903 | AB_312846 (BioLegend Cat. No. 101903) |
| PE/Cy7 anti-mouse CD62L Antibody | Biolegend | 104417 | AB_313102 (BioLegend Cat. No. 104417) |
| PE/Cy7 anti-mouse I-A/I-E (MHCII) Antibody | Biolegend | 107629 | AB_2290801 (BioLegend Cat. No. 107629) |
| PE/Dazzle 594 anti-mouse CD4 Antibody | Biolegend | 100565 | AB_2563684 (BioLegend Cat. No. 100565) |
| Percoll solution | Biochrom | L6115 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD44 Antibody | Biolegend | 103031 | AB_2076206 (BioLegend Cat. No. 103031) |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse Gr-1 Antibody | Biolegend | 108427 | AB_893561 (BioLegend Cat. No. 108427) |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 12559069 | |
| Round-Bottom Tubes with cell strainer cap | STEMCELL Technologies | 38030 | |
| TruStain fcX anti-mouse CD16/32 | Biolegend | 101301 | AB_312800 (BioLegend Cat. No. 101301) |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T6146 | |
| Zombie NIR Fixable Viability Kit | Biolegend | 423105 | viablity stain |
Referências
- Guh, D. P., et al. The incidence of co-morbidities related to obesity and overweight: A systematic review and meta-analysis. BMC Public Health. 9, 88 (2009).
- Prentki, M. Islet β cell failure in type. J Clin Invest. 116 (7), 1802-1812 (2006).
- Shoelson, S. E., Lee, J., Goldfine, A. B. Inflammation and insulin resistance. Journal of Clinical Investigation. 116 (7), 1793-1801 (2006).
- Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444, 840 (2006).
- Exley, M. A., Hand, L., O’Shea, D., Lynch, L. Interplay between the immune system and adipose tissue in obesity. Journal of Endocrinology. 223 (2), R41-R48 (2014).
- Ferrante, A. W. Macrophages, fat, and the emergence of immunometabolism. Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 4992-4993 (2013).
- Winer, D. A., et al. B cells promote insulin resistance through modulation of T cells and production of pathogenic IgG antibodies. Nature Medicine. 17, 610 (2011).
- Onodera, T., et al. Adipose tissue macrophages induce PPARγ-high FOXP3(+) regulatory T cells. Scientific Reports. 5, (2015).
- Lackey, D. E., Olefsky, J. M. Regulation of metabolism by the innate immune system. Nature Reviews Endocrinology. 12, 15 (2015).
- Calle, E. E., Kaaks, R. Overweight, obesity and cancer: epidemiological evidence and proposed mechanisms. Nature Reviews Cancer. 4, 579 (2004).
- Ibrahim, S. H., Hirsova, P., Malhi, H., Gores, G. J. Animal Models of Nonalcoholic Steatohepatitis: Eat, Delete, and Inflame. Digestive Diseases and Sciences. 61 (5), 1325-1336 (2016).
- Beura, L. K., et al. Recapitulating adult human immune traits in laboratory mice by normalizing environment. Nature. 532 (7600), 512-516 (2016).
- Sbierski-Kind, J., et al. Distinct Housing Conditions Reveal a Major Impact of Adaptive Immunity on the Course of Obesity-Induced Type 2 Diabetes. Frontiers in Immunology. 9 (1069), (2018).
- Japp, A. S., et al. Wild immunology assessed by multidimensional mass cytometry. Cytometry Part A. 91 (1), 85-95 (2017).
- Benedict, M., Zhang, X. Non-alcoholic fatty liver disease: An expanded review. World Journal of Hepatology. 9 (16), 715-732 (2017).
- McNelis, J. C., Olefsky, J. M. Macrophages, Immunity, and Metabolic Disease. Immunity. 41 (1), 36-48 (2014).
- Ferrante, A. W. The Immune Cells in Adipose Tissue. Diabetes, Obesity & Metabolism. 15, 34-38 (2013).
- Bertola, A., et al. Hepatic expression patterns of inflammatory and immune response genes associated with obesity and NASH in morbidly obese patients. PloS One. 5 (10), e13577 (2010).
- Turnbaugh, P. J., Bäckhed, F., Fulton, L., Gordon, J. I. Diet-Induced Obesity Is Linked to Marked but Reversible Alterations in the Mouse Distal Gut Microbiome. Cell Host & Microbe. 3 (4), 213-223 (2008).
- Singh, R. K., et al. Influence of diet on the gut microbiome and implications for human health. Journal of Translational Medicine. 15 (1), 73 (2017).
- Müller, V. M., et al. Gut barrier impairment by high-fat diet in mice depends on housing conditions. Molecular Nutrition & Food Research. 60 (4), 897-908 (2016).
