High-Resolution Imaging af nuklear dynamik i levende celler under Uniaxial træk stamme
Summary
Ved hjælp af en tidligere designet enhed til at anvende mekanisk belastning til vedklædnings celler, dette papir beskriver en redesignet substrat geometri og et tilpasset apparat til høj opløsning enkelt celle billedbehandling af anstrengte celler med en 100x olie fordybelse mål.
Abstract
Ekstracellulær mekanisk stamme er kendt for at fremkalde celle fænotypiske reaktioner og har fysiologiske relevans i flere vævs systemer. For at indfange effekten af anvendt ekstracellulær træk stamme på cellepopulationer in vitro via biokemiske assays, en anordning er tidligere blevet designet, som kan være fremstillet enkelt og er lille nok til at passe inde væv kultur inkubatorer, samt på toppen af mikroskop stadier. Det tidligere design af Polydimethylsiloxan substrat tillod imidlertid ikke subcellulær billeddannelse i høj opløsning via olie-nedsænkning mål. Dette arbejde beskriver en redesignet geometri af Polydimethylsiloxan substrat og en tilpasset Imaging setup, der tilsammen kan lette høj opløsning subcellulær billeddannelse af levende celler, mens under anvendt belastning. Denne substrat kan bruges med den samme, tidligere designede enhed og dermed har de samme fordele som anført ovenfor, ud over at tillade høj opløsning optisk billedbehandling. Udformningen af Polydimethylsiloxan substrat kan forbedres ved at indarbejde et gitter, som vil lette sporing af samme celle før og efter anvendelsen af stammen. Repræsentative resultater viser høj opløsning tidsforskudt billeddannelse af optælling mærkede kerner i anstrengte celler fanget ved hjælp af den metode, der er beskrevet her. Disse nukleare dynamik data giver indsigt i den mekanisme, som anvendes trækstyrke stamme fremmer differentiering af oligodendrocyte progenitorceller.
Introduction
Celler og væv i kroppen er udsat for forskellige mekaniske stikord, herunder træk stammer. Men virkningerne af disse stikord på biologi neurale celler er endnu ikke blevet undersøgt udførligt og forstået fuldt ud. I det centrale nervesystem omfatter kilderne til mekanisk belastning udviklings vækst1,2,3,4, fysiologiske processer såsom bøjning af rygmarv, blod og cerebrospinalvæske pulsation, og patologiske tilstande såsom traumer, Axon hævelse, glia ardannelse, eller tumorvækst5,6,7,8. Det er værd at undersøge, hvordan trækstyrke påvirker differentieringen af oligodendrocytter og den efterfølgende myelination af axoner, som er en kritisk proces i det hvirveldyr centrale nervesystem. Ved hjælp af en specialdesignet stamme enhed og elastomer flerhulsplader plader, tidligere værker9,10 har vist, at statisk uniaksial stamme kan øge oligodendrocyt differentiering via globale ændringer i genekspression 10. for at opnå yderligere forståelse af mekanismerne for belastnings mekanismetransduktion i disse celler, skal det foregående forsøgs apparat redesignet som beskrevet her for at muliggøre højopløsnings fluorescens-afbildning af nuklear dynamik i levende celler under pres. Specifikt er en enkelt-brønd Polydimethylsiloxan plade udviklet, og billedbehandlings konfigurationen er redesignet til at give mulighed for time-lapse Imaging af levende celler under belastning ved hjælp af en 100x olie fordybelse linse. For at eliminere de negative optiske virkninger af Polydimethylsiloxan i lysvejen, er cellerne ikke gennem Polydimethylsiloxan-pladen, men i omvendt position, gennem dækglasset, der dækker celle rummet. Ved hjælp af denne nye Imaging design, hundredvis af høj opløsning time-lapse film registreres, af individuelle cellekerner i intakt vedstående celler, hvor kromatin er mærket ved tagging Histon H2B til grøn fluorescerende protein. Disse film viser, at træk stamme inducerer ændringer i kromatin struktur og dynamik, der er i overensstemmelse med progression af oligodendrocyt differentiering.
Levende celle afbildning under påført belastning er teknisk udfordrende og kræver et enheds design, der er kompatibelt med mikroskop systemet. Det brugerdefinerede design, der beskrives her, udgør et billigt alternativ til kommercielle løsninger. Dens dimensioner gør det muligt at installere på mikroskop stadier og levende celle Imaging ved høj rumlig opløsning under anvendt stamme. Billedbehandlings opsætningen er designet til at lette levende celle billeder ved hjælp af en 100x olie fordybelse linse med den højeste klarhed, gennem dækglasset, ikke gennem lag af Polydimethylsiloxan plade, som ellers nedsætter billedkvaliteten og er almindelig i de fleste billedbehandlings opsætninger under belastning. Enheden, med en monteret plade, der indeholder celler, kan også opbevares let i inkubator. Denne enhed er designet til at anvende uniaksial stamme til substrater, der letter vedklædelig cellekultur og opretholder en stabil og ensartet stamme over flere dage. Opsætningen, der beskrives her, kan bruges til højopløselig billedbehandling af forskellige vedhæng ende celletyper under belastning, hvilket gør den anvendelig på mekanisotransduktion undersøgelser inden for mange områder af celle mekaniobiologi.
Protocol
Representative Results
Discussion
En anordning er tidligere1 blevet konstrueret til anvendelse af ekstracellulær trækstyrke på vedklædige celler. Designet af polydimethylsiloxansubstratum i dette arbejde var tilstrækkeligt til biokemiske assays samt lavopløselige billeder af strakte celler. I dette arbejde, under stratum blev redesignet, og en ny Imaging konfiguration, der letter høj opløsning subcellulære levende celle Imaging blev introduceret. Fordelene ved dette system er talrige: det kan bygges in-Lab ved hjælp af e…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Alle forfattere anerkender taknemmeligt finansieringsstøtte fra den nationale forskningsfond i Singapore gennem Singapore-MIT Alliance for Research and Technology (SMART) BioSystems og Micromechanics (BioSyM) tværfaglige forskningsgruppe. Forfatterne Dr. Jagielska og Dr. van Vliet anerkender også taknemmeligt støtte og støtte fra saks-Kavanaugh Foundation. Forfatterne takker William Ong og Dr. Sing Yian chew fra Nanyang Technological University, Singapore, for at give rotte oligodendrocyt progenitorceller for nogle eksperimenter, der er beskrevet i dette arbejde, og forfatterne takke Dr. G. V. Shivashankar fra Mechanobiology Institute, National University of Singapore, Singapore, med henblik på diskussioner om udsving i nukleare områder.
Materials
| Primary cells | Primary Oligodendrocyte Progenitor Cells isolated from Neonatal Rats were provided by Dr. S. Y. Chew's lab at Nanyang Technological University |
||
| Media | |||
| DMEM high glucose | Gibco | 11996-065-500ml | |
| Pen/Strep | Gibco | 15070-063-100ml | |
| FGF | Prospec | CYT-608-50ug | |
| PDGF | Prospec | CYT-776-10ug | |
| Media Stock components | |||
| BSA | Sigma | A9418-10G | |
| Progesterone | Sigma | P8783-1G | |
| Putrescine | Sigma | P5780-5G | |
| Sodium Selenite | Sigma | S5261-10G | |
| Tri-iodothyronine | Sigma | T6397-100MG | |
| Thyroxine | Sigma | T1775-100MG | |
| Holo-Transferrin | Sigma | T0665-500MG | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Mold and PDMS plate | |||
| PDMS – Dow Corning Sylgard 184 | Ellsworth | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Mold – Liquid Plastic | Smooth-On | Smooth Cast 310 – Trail Size | |
| Substrate Coatings | |||
| poly-D-lysine | Sigma | P6407-5MG | |
| Fibronectin | Sigma | F1141-2MG | |
| Histone staining | |||
| CellLigt H2B-GFP BacMam | Molecular Probes | C10594 | |
| Surface functionalization | |||
| APTES | Sigma | A3648-100ml | |
| BS3 | Covachem | 13306-100mg | |
| HEPES buffer pH 8.0 | Alfa Aesar | J63578-AK-250ml | |
| Cell detachment | |||
| Accutase | Invitrogen | A1110501-100ml |
Referências
- Bray, D. Mechanical tension produced by nerve cells in tissue culture. Journal of Cell Science. 410, 391-410 (1979).
- Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension. Biologia do Desenvolvimento. 389, (1983).
- Van Essen, D. C. A tension-based theory of morphogenesis and compact wiring in the central nervous system. Nature. , (1997).
- Smith, D. H. Stretch growth of integrated axon tracts: Extremes and exploitations. Progress in Neurobiology. 89, 231-239 (2011).
- Cullen, D. K., Simon, C. M., LaPlaca, C. M. Strain rate-dependent induction of reactive astrogliosis and cell death in three-dimensional neuronal-astrocytic co-cultures. Brain Research. , 103-115 (2011).
- Fisher, E., et al. Imaging correlates of axonal swelling in chronic multiple sclerosis brains. Annals of Neurology. 2, 219-228 (2007).
- Nikić, I., et al. A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Nature Medicine. 17, 495-500 (2011).
- Payne, S. C., Bartlett, C. A., Harvey, A. R., Dunlop, S. A., Fitzgerald, M. Functional loss during chronic secondary degeneration in rat optic nerve. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53, (2018).
- Zeiger, A. S., et al. Static mechanical strain induces capillary endothelial cell cycle re-entry and sprouting. Physical Biology. 13, 1-16 (2017).
- Jagielska, A., et al. Mechanical strain promotes oligodendrocyte differentiation by global changes of gene expression. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 93 (2017).
- Pajerowski, J. D., Dahl, K. N., Zhong, F. L., Sammak, P. J., Discher, D. E. Physical plasticity of the nucleus in stem cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1, 0 (2007).
- Talwar, S., Kumar, A., Rao, M., Menon, G. I., Shivashankar, G. V. Correlated spatio-temporal fluctuations in chromatin compaction states characterize stem cells. Biophysical Journal. 104, 553-564 (2013).
- Makhija, E., et al. Mechanical strain alters cellular and nuclear dynamics at early stages of oligodendrocyte differentiation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 59 (2018).
