Integrin gerginlik çeşitli hücre işlevlerinde önemli rol oynar. Bir bütünleştirici gerilim sensör ile integrin gerginlik picoNewton (pN) hassasiyeti ile kalibre edilmiş ve Mikronaltı çözünürlükte görüntüsü.
Moleküler gerilim integrin-ligand bağları ile bulaşan birçok hücre fonksiyonları ve davranışları önemli rol oynayan integrin yolu temel mekanik sinyal olduğunu. Kalibre ve integrin gerilim yüksek kuvvet duyarlılık ve Uzaysal çözünürlük ile görüntü için geliştirdiğimiz bir bütünleştirici gerilim sensör (ITS), bir DNA tabanlı floresan gerilim sensör. Its moleküler gerilim sürdürülmesi Eğer bulabilsem böylece kuvvet moleküler seviyede floresan sinyal dönüştürme etkinleştirilir. Its harekete geçirmek için gerilim eşik tunable iyi kameranın dinamik alanı hücreleri integrin gerginlik kapakları pN 10-60 aralığında. Bir Its ile aşılı bir yüzey üzerinde integrin gerginlik yapışık hücreleri floresan tarafından görüntülenir ve Mikronaltı çözünürlükte görüntülü. Its da canlı hücreleri ve sabit hücreleri hücre yapısal görüntüleme ile uyumludur. Its çalışma trombosit daralma ve hücre geçiş başarıyla uygulandı. Bu kağıt için prosedür sentezi ve hücresel kuvvet integrin ile bulaşan insan Its uygulama ayrıntıları.
Hücreleri integrinler uygun ve hücre dışı matriks hücresel kuvvetlerinin uygulamak için güveniyor. Integrin aracılı hücre adezyon ve güç iletim1,2, geçiş3,4ve hayatta kalma5,6,7yayılan hücre için çok önemlidir. Uzun vadede integrin biyomekanik sinyal Hücre proliferasyonu8,9,10 ve farklılaşma11,12de etkiler. Araştırmacılar ölçmek için çeşitli yöntemler geliştirdik ve harita integrin ile bulaşan cep cep-matris arayüzü zorlar. Bu yöntemler elastik terkedilemeyen13tarihinde dayanmaktadır, dizi micropost14, ya da Atomik Kuvvet Mikroskobu (AFM)15,16. Elastik terkedilemeyen ve micropost yöntemleri hücresel stres raporu ve Uzaysal çözünürlük açısından kısıtlamaları ve duyarlılık zorlamak için yüzeylerde deformasyon üzerinde güveniyor. AFM yüksek kuvvet duyarlılığa sahiptir ama aynı anda birden çok noktalarda kuvvet algılayamaz, hücresel kuvvet eşlemek üzere integrinler tarafından iletilen.
Son yıllarda, moleküler seviyede hücresel kuvvet çalışma için çeşitli teknikler geliştirilmiştir. Polietilen glikol17,18, spider ipek peptid19ve DNA20,21,22,23 dayalı moleküler gerilim sensörler topluluğu için geliştirilmiştir görselleştirmek ve gerginlik moleküler proteinler tarafından iletilen izlemek. Bu teknikler arasında gerginlik sentez malzeme ölçmek gibi urgan (TGT), canlı hücreleri22,24integrin gerginlik üst sınırı gelen bir rupturable bağlayıcı DNA ilk kabul edilmiştir. Daha sonra DNA ve floresan rezonans transfer tekniği kombine saç tokası floresan gerginlik DNA tabanlı sensörler oluşturmak için ilk Chen’in grup23 ve Salaita’nın grup20tarafından. Saç tokası DNA tabanlı gerilim sensör integrin gerginlik gerçek zamanlı raporlar ve hücresel işlevler21bir dizi çalışma için başarıyla uygulandı. Daha sonra Wang’ın laboratuvar rapor integrin gerginlik fluorophore-içki çiftine TGT birlikte. Bu sensör bir Its25,26olarak adlandırılır. Its çift iplikçikli DNA (dsDNA) dayanır ve integrin gerginlik kalibrasyon için daha geniş dinamik alan (10-60 pN) vardır. Saç tokası sensörleri, DNA tabanlı aksine Its hücresel kuvvet içinde gerçek-zaman rapor ama hücresel kuvvet ayak izi tüm tarihi integrin olayları kaydeder; Bu sinyal birikimi işlem Imaging, uygun görüntü hücresel gücüne bile düşük-uç floresan mikroskop ile yapım o hücresel kuvvet için duyarlılık geliştirir. Its sentezi iki tek iplikçikli DNA’lar (ssDNA) hybridizing tarafından oluşturulduğu gibi nispeten daha kolaydır.
Its integrin peptid ligand (şekil 1) biotin, bir fluorophore, bir içki (kara delik içki 2 [BHQ2])27ve bir döngüsel arginylglycylaspartic asit (RGD) peptid28 ile Birleşik bir 18 Bankası eşleştirilen dsDNA var. Alt strand fluorophore ile Birleşik (Cy3 Cy5 veya Alexa serisi gibi diğer boyalar ise bu el yazması kullanılır, aynı zamanda bizim laboratuarımızda uygun kanıtlanmıştır) ve hangi ile Its immobilize bir substrat biotin avidin bağ ile biotin etiketi. Üst strand RGD peptid ve Cy3 yaklaşık % 98’i su verme verimliliği26,27ile quenches kara delik içki ile Birleşik. Bu raporda sunulan ile bir yüzey üzerinde Its kaplama yoğunluğu 1100/µm2iletişim kuralıdır. Bu daha önce aynı protokolü29kaplama takip ederek neutrAvidin functionalized substrat kaplı 18 bp biotinylated dsDNA için kalibre yoğunluğudur. Its ile kaplı yüzey hücreleri uymak, integrin RGD aracılığıyla Its bağlar ve gerginlik için Its iletir. Its Its 2 s22içinde dsDNA mekanik olarak ayıran gerilim eşik olarak tanımlanan belirli gerilim toleransı (Ttol) vardır. ONUN rüptürü integrin gerilim tarafından içki ayrılması daha sonra Floresans yayar boya yol açar. Sonuç olarak, görünmez integrin gerginlik bir floresan sinyale dönüştürülür ve hücresel kuvvet Floresans görüntüleme tarafından eşleştirilebilir.
Its uygulama göstermek için balık keratocyte burada, hücre geçiş çalışma30,31,32için yaygın olarak kullanılan hücre modeli, CHO-K1 cep, yaygın olarak kullanılan nonmotile hücre kültürünü ve NIH 3T3 fibroblast kullanın. Coimaging integrin gerginlik ve hücre yapıları da yapılır.
Cep için güçlü teknik zorlamak henüz sentezi ve uygulama açısından eşleme Its son derece erişilebilir değil. Tüm malzemeler hazır Its 1 gün içinde sentez. Deneyler sırasında yüzey kaplama sadece üç adımdan önce hücre kaplama ihtiyaç vardır. Son zamanlarda, biz daha fazla bir adım kaplama yordamına doğrudan sığır serum albümin, cam veya polistiren yüzeyler33Its doğrudan fiziksel adsorpsiyon sağlayan Its bağlayarak Basitleştirilmiş. Its hücresel güç sinyal h?…
The authors have nothing to disclose.
Bu eser tarafından Ulusal Genel tıbbi Bilimler Enstitüsü (R35GM128747) ve Iowa State Üniversitesi tarafından sağlanan başlangıç Fonu tarafından desteklenmiştir.
BSA-biotin | Sigma-Aldrich | A8549 | |
Neutravidin | Thermo Fisher Scientific | 31000 | |
Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | 434301 | |
upper strand DNA | Integrated DNA Technologies | N/A | Customer designed. DNA sequence is shown in PROTOCOL section |
lower strand DNA | Integrated DNA Technologies | N/A | Customer designed. DNA sequences are shown in PROTOCOL section. |
sulfo-SMCC | Thermo Fisher Scientific | A39268 | |
Cyclic peptide RGD with an amine group | Peptides International | PCI-3696-PI | |
IMDM | ATCC | 62996227 | |
FBS | ATCC | 302020 | |
Penicillin | gibco | 15140122 | |
TCEP | Sigma-Aldrich | C4706 | |
200 uL petri dish | Cellvis | D29-14-1.5-N | |
NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | N/A | spectrometer |
SE410 Tall Air-Cooled Vertical Protein Electrophoresis Unit | Hoefer | SE410-15-1.5 | Device for electroporesis |
CHO-K1 cell line | ATCC | CCL-61 | |
NIH/3T3 cell line | ATCC | CRL-1658 | |
Anti-Vinculin Antibody | EMD Millipore | 90227 | Primary antibody for vinculin immunostaining |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Superclonal Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A28175 | Secondary antibody for vinculin immunostaining |
Alexa Fluor 647 Phalloidin | Invitrogen | A22287 | |
Eclipse Ti | Nikon | N/A | microscope |