Tensão de integrina tem um papel importante em várias funções da célula. Com um sensor de tensão Integrativa, integrina tensão é calibrado com sensibilidade de picoNewton (pN) e cuja imagem em resolução de submicron.
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Artigo de método
Imagem latente integrina tensão e força celular com resolução de Submicron com um Sensor de tensão Integrativa
Neste artigo
Resumo
Resumo
Tensão molecular transmitido pelos títulos de integrina-ligante é o sinal mecânico fundamental na via da integrina que tem um papel significativo em muitas funções celulares e comportamentos. Para calibrar e imagem integrina tensão com força alta sensibilidade e resolução espacial, desenvolvemos um sensor de tensão Integrativa (ITS), um sensor de tensão fluorescente baseado em DNA. O SIB é ativado para fluorescência se sustentar uma tensão molecular, convertendo assim força de sinal fluorescente a nível molecular. O limite de tensão para sua ativação é ajustável na faixa de 10 a 60 pN que cobre bem a gama dinâmica de integrina tensão nas células. Sobre um substrato enxertado com um ITS, a integrina tensão das células aderentes é visualizada por fluorescência e fotografada em resolução de submicron. O SIB é também compatível com imagem estrutural de célula em células vivas e células fixas. O SIB foi aplicado com êxito para o estudo da contração das plaquetas e a migração celular. Este documento detalha o procedimento para a síntese e a aplicação do SIB no estudo da força celular integrina-transmitidos.
Introdução
Células dependem de integrinas de aderir e exercer forças celulares de matriz extracelular. Transmissão de força e adesão celular mediada por integrina são cruciais para a célula espalhando1,2, migração3,4e sobrevivência5,6,7. A longo prazo, integrina biomecânico sinalização também influi na célula proliferação8,9,10 e diferenciação11,
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Protocolo
Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC, 8-16-8333-eu) de Iowa State University e institucional Cuidado Animal.
1. síntese do sensor de tensão Integrativa
- Personalizar e ordem ssDNAs (consulte a Tabela de materiais).
Nota: As sequências ssDNA são como segue. A vertente superior é /5ThioMC6-D/GGG AGG ACG CAG CGG GCC/3BHQ_2 /. As vertentes mais baixas são os seguintes.
pN 12 ITS: / 5Cy3//3Bio/ GGC CCG CTG CGT CCT CCC
pN 23 ITS: / 5Cy3//iBiodT/ GGC CCG CTG CGT CC CCC
33 pN ITS: / 5Cy3/GGC CCG CTG CG/iBiodT/CCT CCC
43 pN ITS: / 5Cy3/CGT CCT CCC GGC CCG C/iBiodT/G
54 ....
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Resultados
Com o seu, o mapa de tensão integrina de keratocytes de peixe foi capturado. Isso mostra que um keratocyte migra e gera tensão integrina em duas faixas de força (Figura 2A). A resolução do mapa força foi calibrada para ser 0,4 µm (Figura 2B). Integrina alta tensão se concentra na margem posterior (Figura 3A). O SIB também mostra diferentes padrões específicos de células diferentes. Uma célula imóveis.......
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Discussão
O SIB é um altamente acessível ainda poderosa técnica para celular mapeamento em termos de síntese e a aplicação de força. Com todos os materiais prontos, o ITS podem ser sintetizados dentro de 1 dia. Durante as experiências, apenas três passos do revestimento de superfície são necessários antes de chapeamento de célula. Recentemente, simplificou ainda mais o procedimento de revestimento de um passo vinculando diretamente o ITS a albumina de soro bovino, que permite a adsorção física direta do SIB para vidro ou superfíci.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelo fundo de inicialização fornecido pela Iowa State University e pelo Instituto Nacional de General Medical Ciências (R35GM128747).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| BSA-biotina | Sigma-Aldrich | A8549 | |
| Neutravidina | Thermo Fisher Scientific | 31000 | |
| Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | 434301 | |
| DNA de fita superior | Tecnologias de DNA integradas | /A | Projetado pelo cliente. A sequência de DNA é mostrada na seção PROTOCOLO |
| DNA de fita inferior | Tecnologias de DNA integradas | N / A | Projetado pelo cliente. As sequências de DNA são mostradas na seção PROTOCOLO. |
| sulfo-SMCC | Thermo Fisher Scientific | A39268 | |
| Peptídeo cíclico RGD com um grupo amina | Peptídeos International | PCI-3696-PI | |
| IMDM | ATCC | | |
| FBS | ATCC | 302020 | |
| Penicilina | gibco | 15140122 | |
| TCEP | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| 200 uL placa de Petri | Cellvis | D29-14-1.5-N | |
| NanoDrop 2000 | Espectrômetro | Thermo Scientific | N/A |
| SE410 Unidade de Eletroforese de Proteína Vertical Refrigerada a Ar Alta | Hoefer | SE410-15-1.5 | Dispositivo para eletroporese |
| CHO-K1 linha celular | ATCC | CCL-61 | |
| NIH / 3T3 linha celular | ATCC | CRL-1658 | |
| Anticorpo anti-vinculina | EMD Millipore | 90227 | Anticorpo primário para imunocoloração de vinculina |
| Anticorpo secundário superclonal de cabra IgG (H + L) de cabra, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A28175 | Anticorpo secundário para imunocoloração de vinculina |
| Alexa Fluor 647 Faloidina | Invitrogen | A22287 | |
| Eclipse Ti | Nikon | N/A | microscópio |
Referências
- Price, L. S., Leng, J., Schwartz, M. A., Bokoch, G. M. Activation of Rac and Cdc42 by Integrins Mediates Cell Spreading. Molecular Biology of the Cell. 9 (7), 1863-1871 (1998).
- Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell Spreading and Focal ....
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Reimpressões e permissões
