Insan kaynaklı pluripotent kök hücresini kullanma- Salmonella ve diğer patojenlere karşı epitelyal hücre korumasını Incelemek ve değiştirmek Için bağırsak organoidleri türetilmiştir

Summary

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücresi (hiPSC)-türev intestinal organoidler enterik hastalıkları model almak için heyecan verici fırsatlar sunar. Biz bağırsak organoidler (ıhos), bu iHOs sitokinler ile stimülasyon ve Salmonella typhimurium IFO lümen içine Mikroenjeksiyonu, bu tarafından bir epitelyal invazyonu çalışma sağlayan hipeplerin farklılaşma göstermek Patojen.

Abstract

Bağırsak ‘ organoid ‘ (iHO) sistemi, burada insan bağırsak epitelyal astar 3-D yapıları temsilcisi insan indüklenen pluripotent kök hücrelerden üretilen (hiPSCs) ve kültürde tutulan, kolaylaştırmak için heyecan verici bir fırsat sağlar Enterik enfeksiyonlara epitelyal tepkisini modelleme. In vivo, intestinal epitelyal hücreler (ıecs) bağırsak homeostazisini düzenleyen önemli bir rol oynar ve doğrudan patojenleri inhibe edebilir, ancak bu meydana gelen mekanizmalar tamamen aydınlatılmış değildir. Sitokin Interleukin-22 (Il-22) enfeksiyona yanıt olarak antimikrobiyal peptidler ve kemoinler bir serbest inducing dahil olmak üzere, bağırsak epitelyal bariyer bakım ve savunma rol oynamak için gösterilmiştir.

Biz bir Bodrum membran matris tabanlı prointestinal kültür sistemi içine katıştırmadan önce kendi kültür ortamına spesifik sitokin kombinasyonları ilavesi ile ıhos içine sağlıklı kontrol hiPSCs farklılaşma açıklanmaktadır. Gömülü bir kez, iHOs medyada Noggin, R-spondin-1, epidermal büyüme faktörü (EGF), CHIR99021, prostaglandin E2 ve Y-27632 Dihidroklorür monohidrat ile takviye yetiştirilen. IHO ultrastrture el kesintisi ile haftalık pasajlar, bazı Crypt/villus yapısı sergileme ile tomurşmuş iHOs oluşumuna yol. Tüm ıhos, her bir hücre alt kümesinin belirli belirteçleri için immünostasyon yoluyla teyit edilebilir kadeh hücreleri, enteroendokrin hücreler, Paneth hücreleri, ve polarize Enterocytes oluşan bir farklılaşmış epitelyum göstermek, şanzıman Elektron Mikroskopisi (TEM) ve nicel PCR (qPCR). Enfeksiyon modeli için, Salmonella enterica serovar typhimurium SL1344 ıhos lümen içine mikroenjekte ve 37 °c ‘ de 90 dk için inküsyon, ve değiştirilmiş bir gentanisin koruma tahlil, hücre içi seviyeleri belirlemek için gerçekleştirilir bakteriyel invazyon. Bazı ıhos da bu sitokin Salmonella enfeksiyonu karşı koruyucu olup olmadığını belirlemek için enfeksiyondan önce rekombinant insan Il-22 (rhİL-22) ile ön tedavi edilir.

Introduction

Son yıllarda, ev sahibi-patojen etkileşimlerin çalışması ‘ organoid ‘ modellerinin gelişimi ile geliştirilmiştir, burada bağırsak epitelin 3-D temsilleri çeşitli progenitors üretilebilir. ‘ Primary ‘ organoidler doğrudan bağırsak biyopsilerinde hasat edilen bağırsak kök hücrelerinden oluşturulabilir. Ayrıca, bağırsak organoidleri hiPSCs ‘den oluşturulabilir. Aynı çeşitli dokularda söylenir, gastrik¹, karaciğer², pankreatik^3,4, beyin^5,6, akciğer⁷, ve prostat⁸ organoids birçok araştırmacı tarafından model için kullanılan Hastalığı. Orada nevuslardır sistemi çok sayıda heyecan verici uygulamalar vardır, modelleme kanseri⁹ ve ilaç taraması¹⁰dahil, ama burada biz bir enfeksiyon modeli olarak ihos kullanımına odaklanmak, S kullanarak. enterica serovar typhimurium (S. Typhimurium) örnek bir patojen olarak ve bir terapi olarak Il-22 ile ön tedavi.

Bu çalışmada, IDEO oluşturmak için kullanılan hiPSCs, sağlıklı bir birey tarafından oluşturulan ve ınsan kaynaklı pluripotent kök hücreler girişimi Konsorsiyumu (Hipscı; www.hipsci.org), karakterize bir açık erişim referans paneli olan ‘ Kolf2 ‘ ıpscs vardır hiPSC hatları¹¹. Hipscs organoids için ataları olarak kullanmanın bir avantajı, artık sağlıklı donör IPSC hatları mevcut geniş bankalar, sonuç farklı genetik kökenden hücre hatları bir dizi doğrulanabilir anlamına gelmektedir. Buna ek olarak, araştırmacılar belirli hastalık ilişkili tek nüklotit polimorfizmleri (SNPs) bakmak istiyorsanız, sağlıklı bir hücre hattında mutasyonlar Mühendislik için CRISPR/Cas9 kullanmak mümkündür, böylece hem bir mutant hattı üreten ve izojenik koruyarak Karşılaştırma için kontrol hattı¹². Deneyimimizde hiPSC türevi bağırsak organoidleri, birincil meslektaşlarından daha büyük ve kültürde daha tutarlı, daha az teknik olarak zorlu bir mikroenjeksiyon için yapım ve potansiyel olarak daha çeşitli patojenlere izin vermek Okudu. ıhos cryogenically korunmuş olabilir, ve biz deney için malzeme üretmek için bir yıla kadar IHO kültürlerine yayıldı.

In vivo, ıecs bağırsak homeostazı düzenleyen önemli bir rol oynar ve doğrudan patojenleri inhibe olabilir, bu meydana gelen mekanizmalar iyi anlaşılmayan olmasına rağmen. Sitokin Il-22 bağırsak epitelyal bariyerinin bakım bir rolü olduğu bilinmektedir¹³ ve infeksiyona yanıt olarak antimikrobiyal peptidler ve kemoterapi indüksiyon ve salgılanması yer almaktadır¹⁴. Bu aktif T hücreleri (özellikle, Th17 hücreler) yanı sıra doğal katil (NK) hücreleri tarafından üretilen ve bir Heterodimerik reseptör Il-22r1 ve Il-10r2 altbirimden¹⁵oluşan bağlar. Il-22 reseptörü, iecs üzerinde basally ifade edilir, yani IHO modelinde, sadece kültür orta¹⁶ek olarak rhİL-22 ile organoidler önceden işleme mümkündür. Nevuslardır sisteminin bir dezavantajı, normalde diğer bağışıklık hücresi türleri tarafından teslim ilişkili bağışıklık tepkisi yoksun olmasıdır; Ancak, modelleri daha iyi bu^17,18temsil etmek için bağırsak lenfosit ile rahim organoidler girişimi ortaya çıkmaktadır.

Mikroenjeksiyon sisteminin kullanımı, IHO modelinde enfeksiyonları simüle etmek için anahtardır, çünkü bu, patojenlerin epitelin apikal yüzeyine doğrudan teslim edilmesini sağlar, çünkü In vivo enfeksiyonu durumunda ortaya çıkar. IHO enjekte bakteriyel çözüme fenol kırmızı ilavesi enfekte olanlar işaretler, böylece aynı IHO tekrarlanan enjeksiyonları kaçınarak. Enfeksiyon modelleme için gemiler olarak organoids kullanımda büyüyor, Helicobacter pylorigibi patojenler ile,¹⁹ norovirüs,²⁰ rotavirus,²¹ Shiga toksin üreten Escherichia coli²², Cryptosporidium²³ve Zika virüsü²⁴ hayatta kalmak ve bu sistemler içinde çoğaltmak için gösterildi. Bu teknoloji, özellikle infeksiyon için insan epitelyal tepkisi hakkında doğrudan bilgi elde etmek amacıyla, protozoa veya insan kısıtlı patojenler gibi kültüre zor olan organizmaların daha geniş bir patojenlere uygulanabilir.

Protocol

1. kaynaklı pluripotent kök hücrelerinin kültür ve paslanmaya Not: Burada açıklanan tüm yöntemler, ticari olarak kullanılabilen insan hücresi çizgilerini kullanır. Aşağıda ayrıntılı tüm doku kültürü çalışmaları bir sınıf II laminar akış kaputu yapılmalıdır. ıpscs rutin olarak kök hücre kültürü ortamında tutulur ( malzeme tablosunabakın), üreticinin talimatlarına göre, bir hafta sonu ücretsiz ıpscs kültürü sağlar. ıpscs göreli kolaylığı ile diğer IPSC kültür sistemlerinden uyarlanabilir. Koloniler plaka yüzeyinin yaklaşık% 80-90 ‘ ını kapladıktan sonra hücreleri geçiş. Geçiş için plakaları hazırlayın 1 saat kullanmadan önce, Dulbecco ‘nun fosfat-tamponlu tuzlu (DPBS; kalsiyum olmadan [CA] veya magnezyum [mg]) doku-kültür-tedavi plakalarına kadar seyreltilmiş vitronektin 10 μg/mL eklenerek. Kaplama birimleri plaka boyutuna bağlıdır ve üreticinin talimatında bulunabilir. Bu süre zarfında, sıcak kök hücre kültürü Orta oda sıcaklığında (RT). Medya ıpscs geçiş için hazır çıkarın ve hücreleri 2x DPBS (CA veya mg olmadan) yıkayın. Tabaklar için EDTA solüsyonu ( malzeme tablosunabakın) ekleyin, tüm yüzeyin kaplı olduğundan emin olun ve RT ‘de 5 – 8 dakika boyunca inküye yapın. Delik IPSC kolonilerinin merkezinde görünmeye başlar, Aspire ve EDTA solüsyonu atın. Kuyulara kök hücre kültürü ortamı ekleyin; birkaç kez plaka yüzeyi üzerinde yavaşça yıkama medya tarafından ıpscs çıkarın. Ipscs tek hücreler olarak değil, küme olarak geçmeli, bu nedenle EDTA çözümünün çok uzun süre kalmadı olduğundan emin olun. Herhangi bir iPSCs ‘yi 15 mL Konik Tüpe taşıyın. Vitronektin ön kaplı plakalardan aspirate ve kök hücre kültürü ortamı ile değiştirin. IPSC süspansiyonu, iPSCs ‘nin konik tüpün altına yerleşmez olduğundan emin olmak için bir kaç kez invert edin ve yeni bir plakaya 1:10 seyreltme sağlamak için uygun süspansiyon hacmini ekleyin. Bölünmüş oranlar, IPSC hatları arasında farklılık gösterebilir IPSC büyüme hızına bağlı olarak ayarlanabilir. Ipscs ‘yi yüzeye dağıtmak ve 37 °C/5% CO2’ de bir kuluçl içine yerleştirmek için plakayı kaya. İPSCs ‘yi paslanma sonrası gün besleyin. 2. iPSCs ‘den hindgut ‘a farklılaşma 0. günde, ıpscs ‘yi 10 cm ‘lik doku-kültürü-tedavi edilen bir çanak üzerine bölüştür, adım 1,2 ‘ de açıklandığı gibi vitronektin ile ön kaplı, 10 ml kök hücre kültürü ortamına aktivin a (10 ng/ml) + temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF; 12 ng/ml) ile tamamlayıcı olarak eklenmiştir. Kullanım önce doğrudan ortama büyüme faktörleri ekleyin; tüm sonraki adımlarda bunu. 1. günde, medyayı değiştirin (10 ml kök hücre kültürü ortamı aktivin A [10 ng/ml] + bFGF [12 ng/ml]). Gün 2, aşağıdaki büyüme faktörleri ile tamamlayıcı kök hücre kültürü orta 10 ml medya değiştirerek farklılaşma başlayın: aktivin A (100 ng/ml), bFGF (100 ng/ml), kemik morfogenetik protein 4 (BMP-4; 10 ng/ml), fosfoinositol 3- kinaz inhibitörü LY294002 (10 μM) ve GSK3 inhibitörü CHIR99021 (3 μM). 3. gün, medya değiştirmek 10 ml kök hücre kültürü ortam aktivin A ile tamamlayıcı (100 ng/ml), bFGF (100 ng/ml), BMP-4 (10 ng/ml), ve LY294002 (10 μM). Bu medya tarafından indüklenen endoderm belirtimi sonraki 24 saat içinde IPSC kolonisi morfoloji görünür değişikliklere neden olmalıdır. 4. gün, 10 ml rpmi/B27 medya (100 ng/ml) ve bFGF (100 ng/ml) aktivin ile tamamlayıcı medya değiştirin.Not: Rpmi/B27 medya içerir 500 ml RPMI orta ile L-glutamin takviyesi (bakınız Tablo 1), 10 ml B27 ek (50x, serum ücretsiz), ve 5 ml gereksiz amino asitler. Opsiyonel: 5 mL penisilin-streptomisin (10.000 U/mL) ekleyin. Kullanmadan önce filtre sterilize edin. 5. gün, 10 ml rpmi/B-27 medya için ortam değiştirmek aktivin A (50 ng/ml) ile desteklenmektedir. Gün 6, hindgut posterior endoderm desenle başlamak IÇIN, CHIR99021 (6 μm) + retinoik asit (3 μm) ile tamamlayıcı rpmi/B27 medya 10 ml medya değiştirin. Gün 7, 8ve 9, adım 2,7 yineleyin. Bu adımlar sırasında, hindgut görünür 3-b yapıları belirgin hale, plaka yüzeyini kaplayan olmalıdır. 10. gün, ortaya çıkan hindgut Bodrum membran matris embed ( malzeme tablosunabakın). 3. Bodrum membran matrisinde hindgut gömme IHO baz büyüme medya makyaj (500 mL gelişmiş Dulbecco ‘s modifiye kartal orta [DMEM]/F12, 10 mL B27 takviyesi [50x, serum ücretsiz], 5 ml N2 Supplement [100x, serum serbest], 5 mL 1 M 4-(2-hidroksiil) -1-piperazineethanesulfonik asit (HEPES) ve 5 mL esansiyel olmayan amino asitler [100x]. Opsiyonel: 5 mL penisilin-streptomisin ekleyin [10.000 U/mL]; kullanmadan önce filtre sterilize edin. Bkz. Tablo 1). Hindgut plakadan medyayı çıkarın ve plaka 1x ile DPBS (CA veya mg olmadan) yıkayın. Plakaya 5 ml kolajenaz solüsyonu ekleyin ve 37 °c ‘ de 5 dakika boyunca inküye yapın. Ekleyerek kolajenaz solüsyonu üretmek 500 ileri dmem/F12 400 ml kolajenaz IV toz mg. Bunun ardından, 100 mL serum değiştirme ( malzeme tablosunabakın), 5 ml L-glutamin (200 mm) ve 3,5 μL 2-mercaptoetanol ekleyin ve karışımı için çözüm girdap. Filtreleme-kolajenaz tozu tamamen çözündüğünde solüsyonu sterilize edin.Not: Bu, daha küçük aliquots 6 ay kadar-20 °C ‘ de depolanabilir. Plakaya 5 ml İHO baz büyüme ortamını ekleyerek kolajenaz ‘yi inaktive ederek, bir hücre kazıyıcısı kullanarak hindgut hücrelerinden uzaklaştırın ve 15 ml konik tüpte hindgut süspansiyonu toplayın. 240 x g ‘de santrifüjün 1 dakika ve pipet kapalı supernatant. 10 mL medya ekleyin, yavaşça pipetleme ile küçük parçalar halinde hindgut kırmak ve 1 dakika 95 x g tekrar Santrifüjü. 3,5 adım tekrarı ile IHO baz büyüme medyasında 2x hücreleri yıkayın. Hücreleri temel büyüme orta (~ 300 – 500 μL) küçük bir hacimde resuspend ve 1,5 mL Bodrum membran matris için bu çözümün yaklaşık 100 μL ekleyin. Bu süre zarfında, RT ‘de hızla odaklanmaya başlayacağı için matrisin buzda kalması gerekir. 37 °C ‘ de bir plaka ısıtıcı üzerinde 24-kuyu plaka ayarlayın ve 24-kuyu plakasının bir iyi içine 60 μL nokta. Kısaca ayarlanmasına izin verin ve mikroskobun altında yoğunluğu kontrol edin. Gerekirse, istenilen konsantrasyon elde kadar artışlarla Bodrum membran matris daha hindgut çözüm ekleyin ve kalan kuyuları içine çözüm spot. 37 °C ‘ de 10 dakika boyunca inkübe; daha sonra, aşağıdaki konsantrasyonlarda 24 kuyu plakasının her bir kuyusu için büyüme faktörleri içeren 800 μL iHO baz büyüme ortamını ekleyin (bkz. Tablo 1): 500 ng/ml R-spondin-1, 100 ng/ml Noggin, 100 ng/ml epidermal büyüme faktörü (EGF), 3 μm CHIR99021, 2,5 μm prostaglandin E2 ve 10 μM Y-27632 Dihidroklorür monohidrat (kaya inhibitörü). IHO temel büyüme ortamını her 2 – 3 günde bir veya medya renk kesilmeye başlarsa hemen değiştirin. Bodrum membran matriks içine ilk tohumlama sonra, ıhos 7 gün onları bölme önce geliştirmek için izin verin. 3-4 gün, farklı küreler kültürde görünür olmalıdır. Tek başına medya değişikliği için, Y-27632, bu sadece bölme/tohumlama sırasında gerekli olarak atlayın. 4. iHOs ‘ın bakım ve geçişi Kademeli olarak çözülmesine izin vermek için, 4 °C ‘ de kapalı bir buz kovasında Bodrum membran matrisinin gerekli hacmini çıkarın, bölme işleminden önce 24 saat. Ihos medyasını çıkarın ve 500 μL hücre kaldırma çözeltisi ile değiştirin (bkz. malzeme tablosu) başına iyi. 4 °C ‘ de 40 – 50 dakika boyunca Inküye edin, bu noktada ıhos çözeltinin içinde yüzen olmalıdır. İsteğe bağlı: istenilen morfoloji ile sadece iHOs seçmek için bir in-Hood görüntüleme sistemi kullanın ( malzeme tablosunabakın). IHO/hücre kaldırma çözeltisi süspansiyonu 15 mL konik tüplere hafifçe pipet, ıhos kırmak için değil çalışıyor. Ihos 3 – 5 dk yerleşmek ve süpernatant ve tek hücreleri kaldırmak için izin verin. İHOs ‘ın 5 mL ‘Lik iHO tabanı büyüme ortamına resuspend ve onları yavaşça yıkamak için pipet. 95 x g ‘de santrifüjün 2 dk. 37 °C ‘ de plaka ısıtıcı üzerinde 24 kuyu plakası ayarlayın. Süpernatant kaldırmak ve ıhos pelletini ~ 300-500 μL temel büyüme medya, bir P1000 pipet küçük parçalar halinde ihos kırmak için kullanarak. Uygulanması gereken gücün IHO hattına ve olgunlaşma durumuna bağlı olarak değişebileceğini unutmayın, bu nedenle yavaşça başlayın, gerekirse kuvveti arttırın. Yer ~ 100 μL ıhos (hacim çözeltinin yoğunluğuna bağlıdır) içine 1,5 mL Bodrum membran matris ve pipet kısaca karıştırmak için. Spot dışarı 1 x 60 μL Bodrum membran matris bir iyi 24-kuyu plaka içine, ~ 30 s için katılaşma için bırakın ve sonra mikroskop altında yoğunluğu kontrol edin. Yoğunluk çok düşükse, matrisine daha fazla ıhos ekleyin. Doğru yoğunluğa ulaşılana kadar adım 4,8 yineleyin ve ardından matrisin geri kalanını 24-kuyu plakasına yerleştirin. 10 dakika için 37 °C ‘ de bir kuluçla yerleştirin ve sonra, adım 3,7 ‘ de açıklandığı gibi, büyüme faktörleri ile 800 μL baz büyüme ortamı ile bindirin. Bir istila tahlil deneyi için ıhos hazırlamak için (aşağıda özetlenmiştir), Passage ıhos 4 – 5 gün önce deneme adımları açıklandığı gibi 4.1 – 4.10, ama yer 120 μL matris iHO çözüm içinde oluşturulan 5 mm cam dipli mikroenjeksiyon yemekleri içine adım 4,7. Rutin geçişte olduğu gibi bir damlacık içinde IHO süspansiyon bırakarak yerine, matris ince bir tabaka oluşturmak için çanak alt üzerine damlacık yayıldı. 2,5 mL temel büyüme orta artı büyüme faktörleri ile kapak.Not: Kültür ortamında antibiyotikler kullanılmışsa, mikroenjeksiyon deneyleri için antibiyotik olmayan tamamlayıcı medya ile değiştirilmelidir. 5. rhIL-22 ile iHOs ‘un prestimulation Ihos gelen medya aspirate ve taze temel büyüme medya ile yerine (Antibiyotik içermeyen gerekir) 18 invazyonu tahlil önce saat. RhIL-22 ‘ i kültür ortamına 100 ng/mL son konsantrasyonuna ekleyin. 6. ıhos ve hücre içi Istilanın Mikroenjeksiyonu Deneyden önceki gün, S’i ayarlayın. 10 mL Luria-Bertani suyu içinde typhimurium SL1344 kültürü ve 37 °C ‘ de inküyeler sallama ile gece. Deney gününde, kapalı bir ısı odası olan bir mikroskop varsa, onu açın ve sıcaklığın 37 °C ‘ ye ulaşmasına izin verin. DPBS (CA ve mg içeren) bir gece bakteriyel kültürler seyreltmeli 2 ‘ de 600 Nm (OD600) bir optik yoğunluğa ve daha sonra, o 1:1 fenol kırmızı ile karıştırın. Ihos içeren mikroenjeksiyon tabağı mikroskop aşamasına yükleyin, kapağı çıkarın ve iHOs ‘a enjeksiyonu başlamak için hazır hale getirin. Enjektör ve kol kontrol istasyonlarını açın. Enjektör 600 kPa basınç ve 0,5 s bir enjeksiyon süresi ayarlandığından emin olun. Zaten mikroskop aşamasından yedeklenmez ise, emin olmak için enjeksiyon kolunu döndürün. Sarma ve iğne plastik silindir kaldırarak 6 μm mikroenjeksiyon matkap ucu ayarlayın. Kavrama kafasını enjeksiyon kolundan çıkarın. Matkap ucunu inoculum ile 10 μL ile yükleyin, matkap ucunu hafifçe künt ucuna sürükler. Matkap ucunu kavrama kafasına yerleştirin ve mikroenjeksiyon koluna yeniden takın. İğnenin mikroenjeksiyon tabağı 1 – 2 cm üzerinde olması için kolu yavaşça konuma getirin. İğne ucunu çanak ortasına konumlandırmak için kol kontrolünü kullanın ve sadece medyanın yüzeyinin üzerinde olana kadar aşağı indirin. Tüm enjeksiyonları sonra bu noktaya iğne dönmek için kol kontrol istasyonu programı. Ihos üzerinde mikroskop odaklanmak ve enjekte etmek için hedef seçin. Enjekte edilmesi ve iğne aşağı ve yanal IDEO lümen içine taşımak için sadece yukarıda ve IHO sağında iğne konumlandırın. Mikroenjektör üzerinde enjekte düğmesine basın; Fenol-lekeli bakteriyel karışımı iğne ortaya çıkacak. Her IHO 3x enjekte. Her koşul için en az 30 ıhos enjekte edilir.Not: IHO boyutu ve yapısı içinde heterojenlik nedeniyle bir kültür içinde çok sayıda enjekte etmek gereklidir ıhos değişimi için kontrol etmek. Gerekli tüm ıhos enjekte edildiğinde, sahneden mikroenjeksiyon plakasını çıkarın, kapağı değiştirin ve 37 °C ‘ de 90 dakika boyunca plakayı inküd. 90 dk sonra, büyüme medya Aspire ve hücre kaldırma çözeltisi 3 ml ile değiştirin; 45 dk. için 4 °C ‘ de inkübe Ihos/hücre kaldırma çözümünü, 5 mL DPBS içeren 15 mL konik tüpüne yavaşça taşıyın. Tüm enjekte ıhos plaka kaldırıldı emin olun (gerekirse DPBS 1 mL ile plaka durulayın). 370 x g ‘de 3 dakika Santrifüjü 0,1 mg/ml ‘de gentamin içeren temel büyüme medyasında süpernatant ve pelletini ıhos kaldırın (1 ml medya ekleyin; daha sonra, ıhos kırmak için bir P1000 pipet ~ 50x kullanın ve 4 ml daha fazla medya ekleyin). 37 °C ‘ de 1 saat boyunca inkükülüler bakterileri öldürmek. 3 dakika için 370 x g ‘de ıhos santrifüjler ve mümkün olduğunca az bırakarak, supernatant Aspire. Ihos 1x ‘i DPBS ve santrifüjlerle yıkayın.Not: Bu adım gentaminisi kaldırır, herhangi bir kalan gentaminisin hücreler lysed sonra hücre içi bakteri öldürebilir gibi önemlidir. 500 μL lizis Buffer ( malzeme tablosunabakın) içinde ıhos resuspend ve elle pipetleme ~ 50x tarafından organoids ayırmak. Bu karışımı RT ‘de 5 dakika boyunca bırakın. Seri olarak, 10-1, 10-2ve 10-3 konsantrasyonları oluşturmak için dpbs ‘de ortaya çıkan çözüm 10 kat seyreltin. Prewarmed LB agar plakaları üzerine temiz ve seyreltilmiş çözümlerin 3 x 20 μL damlacıkları pipet. Bir gecede 37 °C ‘ de inküyün ve koloniye sayım ve koloni oluşturan birimlerin (CFU) hesaplanması gerçekleştirin. Koloni sayısı, hücre parçalanması sürecinde yayımlanan hücreler arası bakterilerin numaralarını yansıtacaktır. 7. hücre donma ve kurtarma Not: Daha önce belirtildiği gibi, cryogenically iHOs korumak ve istenilen zaman onları yeniden oluşturmak mümkündür. Donma ve çözme süreçleri aşağıda özetlenmiştir. Dondurmak istediğiniz ıhos ‘un kuyularını seçin. Kuyulara hücre kaldırma çözeltisi ekleyin ve 4 °C ‘ de 40 – 50 dakika boyunca inkübe edin. Ihos çözüm yüzen olmalıdır. Iyhos ‘i 15 mL konik tüpüne hafifçe pipet atın ve yerleşmelerine izin verin. Medyayı çıkarın ve ıhos 1x ‘i temel büyüme medyaları ile yıkayın (büyüme faktörleri yoktur). Santrifüjler at 95 x g için 2 dakika, supernatant kaldırmak, ve hücre donma orta uygun bir hacim ile değiştirmek (malzeme tablosuna bakın; üreticinin talimatlarına göre orta kullanın), kriyojenik şişeleri Içine ıhos dekreme. Daha kademeli donma sağlamak için gece-80 °C dondurucu gecede şişeleri saklayın; sonra, sıvı azot depolama aktarmak. Ihos ‘u yeniden oluşturmak için, 37 °C ‘ de su/boncuk banyosu kullanarak kriyojenik bir şişenin hızla defrost; ardından, içeriğini 10 mL ‘Lik temel büyüme ortamına hafifçe pipet (büyüme faktörü yok). Ihos ‘un yerleşmesine izin verin ve ortamı ~ 300 yeni temel büyüme medyası ile değiştirin. El ile ihos DISSOCIATE etmeyin. İHOs ‘i Bodrum membran matrisine ekleyin ve Bölüm 3 ‘ te açıklandığı gibi plakaya çıkarın.

Representative Results

Farklılaşma sürecinin başlaması sonrasında, hücreler Bodrum membranı matrisine gömülmeden önce ilk endoderm oluşumunun ardından hindgut desenleme aşamasından geçmelidir. Kürasyonlar ve büyük miktarlarda kontamine malzeme ile kültürler ıhos olgun olarak birkaç hafta bir süre içinde açık olacaktır. Farklılaşma, katıştırma ve geçiş sürecinin örnek görüntüleri Şekil 1′ de gösterilir. Mikroenjeksiyon sisteminin kurulumu Şekil 2′ de gösterildiği gibi. Ihos fenol kırmızı/bakteriyel çözüm ile mikroenjekte ve onların kırmızı renk korumak, virüslü ıhos kimliği yinelenen enjeksiyonları önlemek için izin. Kaplama hücre içi bakterilerin sayıları değiştirilmiş gentaminisin koruma tahlil sonrasında gerçekleştirilir; rhIL-22 ile prestimulation S kısıtlar . Typhimurium enfeksiyonu, rhIL-22 tedavisinin ardından daha az hücre içi bakterilerle gözlenen (Şekil 3). Ayrıca, ıEC-bakteriyel etkileşimlerin (Şekil 4) ana bilgisayarın görselleştirilmesini kolaylaştırmak amacıyla enfekte ıhos ‘ı immünostat veya Tem için rutin olarak işiyoruz. Şekil 1: ıhos Için iPSCs yönlendirilmiş farklılaşma. İPSCs ‘den ıhos ‘a farklılaşma temsili dizisi, gözlenen morfolojik değişiklikleri ve bu değişiklikleri sürmek için gereken büyüme faktörlerini göstermektedir. Kesin endoderm, A, FGF, BMP-4, LY294002 ve CHIR99021 birleşimlerinin spesifik konsantrasyonuna maruz kaldıktan sonra, farklılaşma gününde 4 ‘ te oluşur. 8 gün sonra, CHIR99021 ve retinoik asit spesifik konsantrasyonları ile bu kesin endoderm deseni hindgut oluşumunda sonuçlanır. Postgömme, küroid oluşumu görülür. Prointestinal proliferasyon faktörleri R-spondin 1, Noggin, EGF, CHIR99021 ve prostaglandin E2 ile tamamlayıcı orta bir destekleyici Bodrum membran matris kullanarak sürekli geçişten sonra, küreler tomurcuklanmış ıhos içine ilerleme. (Görüntüler 4X-10X büyütme) alınmıştır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız. Şekil 2: SIle bir IHO Mikroenjeksiyonu. Typhimurium. (A) mikroenjeksiyon sistemi (bkz. malzeme tablosuna) çevre odasına kapalı; Bu kontrollü bir ortamda ıhos enjeksiyon sağlar (37 °C/5% CO2). (B) bakteriyel inokulumunu, mikroenjeksiyon sistemine bağlı bir mikrokapiller kullanarak doğrudan IHO lümenine teslim edilir. (C) bakteri inokulantlar fenol kırmızı ile karıştırılarak, hangi ıhos enfekte olduğu açıktır, böylece aynı IHO yinelenen enjeksiyonları kaçınarak. Görüntüleri 10X büyütme alınmıştır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız. Şekil 3: RhIL-22 Ile Kolf2 hücre çizgisinin türetildiği ıhos ön tedavisi S. kısıtlar. Bağırsak epitelyal hücrelerine typhimurium SL1344 invazyonu. Gentaminisin koruma konusunda, ıhos 100 ng/mL rhIL-22 18 h ile enfeksiyon öncesinde tedavi edildi, ya da tedavi edilmedi, ve 90 dk postenfeksiyon için inkübe. Veriler üç biyolojik çoğaltır ± SEM için üç teknik çoğaltır anlamına gelir. Anlamlı testler için Mann-Whitney U testleri kullanıldı; p < 0,0001. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız. Şekil 4: S. typhimurium SL1344 Ile IECs etkileşimi. Bu paneller S ile enjekte ıhos gösterir . Typhimurium SL1344 ve (A) immünofluorescence veya (B) iletim elektron mikroskobu için fiktasyon ve işleme öncesinde 3 h için inkübasyon. Apanelinde, bakteriler IHO lümen içinde görülür ve epitelyum ile etkileşimde bulunur. Çekirdekler 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) dilactate (mavi), phalloidin (kırmızı) ile hücre membranları ve CSA-1 (yeşil) ile bakteri ile lekelenmiş vardır. Görüntüleri 20X büyütme alınır. B paneli, istilanın ardından Salmonella ‘nın üç farklı hücre içi işleme yolunu gösterir; bakterilerin (a) Salmonellaiçeren bir vakumda, (b) sitoplazma içinde ücretsiz ve (c) Autophagy içinde görülür. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız. RPMI/B27 orta Bileşen: Tutar: RPMı 1640 glutamin takviyesi ile medya 500 mL B27 serum-ücretsiz ek 50x 10 mL ‘Lik IHO baz büyüme ortamı Bileşen: Tutar: Gelişmiş DMEM/F12 500 mL B27 serum-ücretsiz ek 50x 10 mL ‘Lik N2 serum-ücretsiz ek 100x 5 mL ‘Lik HEPES 1 M 5 mL ‘Lik L-glutamin 200 mM 5 mL ‘Lik IHO tabanı büyüme ortamı için büyüme faktörleri Bileşen: Tutar: Rekombinant insan R-spondin1 500 ng/mL Rekombinant insan noggin 100 ng/mL Epidermal büyüme faktörü (EGF) 100 ng/mL Prostaglandin E2 2,5 μM CHIR99021 3 μM ‘ si Y-27632 Dihidroklorür monohidrat 10 μM kadar Tablo 1: medya tarifleri.

Discussion

Bu protokol, hiPSCs ‘nin ıhos ‘a ve enterik enfeksiyonları simüle etmek için bir model olarak kendi yarar içine farklılaşma özetliyor. Aşağıda, protokoldeki kritik adımları ve yaptığımız değişiklikleri veya geliştirmeleri özetlemektedir.

Bu protokol daha önce yayınlanmış iş²⁵Ile karşılaştırıldığında hipscs farklılaşma sürecini kolaylaştırır. Daha önce kullanılan yöntemler chemically tanımlı orta – Polivinil alkol (CDM-PVA) için diğer hiPSC kültür sistemlerinden (örn., besleyici bağımlı hiPSC kültürü) hiPSCs aktarımı gerekli. CDM-PVA ‘ y a bu transfer genellikle 2 – 3 hafta sürer ve Hipvıs ‘in günlük beslenmesini gerektirir. Bu protokol de sürekli olarak etkili değildi, bazı farklılaşmalar başarısız oldu; Bu nedenle, aynı büyüme faktörlerini kullanarak farklılaşmaya başladık, ancak kök hücre kültürü ortamında (CDM-PVA yerine) yetiştirilen Hipvonlar ile başlayarak, 0 – 3 farklılaşma günlerinde kök hücre kültürü ile CDM-PVA ‘ nın değiştirilmesi. Bu, bugüne kadar trialed beş bağımsız hiPSC hatları için başarılı oldu, Farklılaşma süreci çok daha hızlı ve verimli hale. Bu Ayrıca, farklılaşma öncesinde hiPSCs ‘nin hafta sonu ücretsiz kültürüne izin verir ve hiPSC kültüründe daha fazla esneklik sağlar. Bu yöntem tarafından üretilen İHO hatları daha önce hipsc hatları Kolf2, Yemz1 ve lise1¹⁶ için tarif ettiğimiz gibi intestinal epitelin belirteçleri için phenotyped edilmiştir ve önceki kullanılarak üretilen ihos gelen fenotipik olarak ayırt edilemez görünür Protokolü.

Tohumlama sonrasında, ıhos en az 1 ay rutin geçişini gerektirir, her 4-7 gün olgunlaşma kolaylaştırmak için bölme ile. Kullanılan IPSC satırına ve ilk kültürün yoğunluğuna bağlı olarak iHO geliştirmesinde bazı varyasyon olacağını unutmayın. İlk birkaç pasajlar sırasında, iHOs olmayan hücreleri gözle görülür şekilde kirletecek. Bunlar sonunda, küresel temiz bir kültür bırakarak, ölecek yaklaşık 4 hafta sonra, ıhos tomurcuklanmış. Buna ek olarak, bir in-Hood görüntüleme sistemi seçmek ve istenilen morfoloji ile sadece ıhos geçiş için kullanılabilir. Ihos olgun olarak, her 6-7 gün, büyüme oranı ve yoğunluğu bağımlı bölme gerektirir. Aşağıdakilerden herhangi biri oluşursa, ıhos bu noktadan önce bölünmüş olmalıdır: iHOs luminal boşluklar ölü hücreler ile doldurmak için başlar, Bodrum membran matris parçalama başlar, ıhos Bodrum membran matris dışarı büyümeye başlar, ya da kültür çok yoğun ve medya çok çabuk sarı gitmeye başlar.

IDEO kültürü kurulduktan sonra, herhangi bir zamanda ihos ‘un görünümü değişirse veya beklenenden farklıysa (örneğin, kültürler budding yerine küresel kalır), immunohistokimya ve qPCR üzerinden fenotiplemeyi hücre işaretçileri için olmalıdır ıhos içinde hücre türlerinin farklılaşma (örneğin, kadeh hücreleri, Paneth hücreleri) bozulmamış kalmasını sağlamak için tekrarlanan. Ihos artık farklılaşıyorsanız, sonra onlar atılır ve redifferated veya iHOs bir önceki geçiş çözülmüş ve reconstituted olmalıdır. Eğer ıhos farklılaştırmak için ateşkes, potansiyel nedenleri kültür yaşı (6 aydan eski ise), büyüme faktörlerinin etkinliği (bu üreticilerin talimatlarına göre reconstituted ve önlemek için küçük plakaya dondurulmuş tutulan emin olun Çoklu donma-çözülme döngüleri), çok sık veya şiddet pasajlar (genel olarak, geçiş sadece haftada bir kez ortaya çıkar, ve eğer ihos elle düzenli olarak çok şiddetle Disosiye, onlar tamamen ayırt etmek için sona erecek).

RNA sıralaması ile kurulan biz Il-22 stimülasyon 18 h enfeksiyondan önce antimikrobiyal genleri ve bariyer savunma fenotipi dahil olanlar upregules. Önce yeni iHsO kullanımı için rhIL-22 ile prestimulation (veya sistem bunun için kullanılırsa alternatif bir sitokin) ile ilgili olarak, o sitokin tarafından updüzenlenmiş olduğu bilinen genlerin etkinliğini kontrol etmek için tavsiye edilir (Il-22 durumunda , biz kullanılan DUOX2 ve LCN2) ile qPCR stimülasyon sonra ıhos, reseptör ifadesi ve bozulmamış sinyalizasyon sağlamak için. Il-22 ‘ i ilk kullanımından önce, Il-22 reseptörün ifadesinin bazal olduğunu belirlemek için ıhos ‘ta Il-22 reseptörlerini bulmak için immunohistokimya gerçekleştirdik, bu da prestimulation ‘in sadece rhIL-22 ‘ i iHO kültürüne ekleyerek elde edilebilir olduğu anlamına gelmektedir. Orta. Ancak, bir reseptör apikal ifade ederse, bu protokol apikal ligin teslim etmek için adapte olması gerekebilir.

Mikroenjeksiyon sistemi ile ilgili tuzaklar genellikle enjeksiyon için gerekli iğneler incelik ile ilgilidir. Burada, 6 μm Lumen ile ticari olarak kullanılabilen matkap uçları kullanıyoruz. Bu daha az üniforma olsa da, iğne ucu veya tutarsız hacimlerin ıhos içine enjekte ediliyor sızıntılarına yol, cam kapillaries²⁶ enjeksiyon iğneler çekmek mümkündür. Enjeksiyon bir boya olarak fenol kırmızısı kullanımı için bir nedeni olan IHO Lumen, içine yer almış emin olmak önemlidir; ıhos gözle görülür bir şekilde genişletecek ve kırmızı inoculum tutacaktır, hangi ıhos enjekte edildiğini kesin izin. Bazen iğneleri iHO duvarından enkaz ile tıkacak; Bu durumda, iğne ucunu IHO içinden çıkarın ve mikroenjeksiyon sistemindeki temiz düğmeye basın. Bu blokaj temizlemek gerekir yüksek hava basıncı kısa bir süre üretecek. Aynı zamanda plaka üzerine bakteriyel inokulumunu bazı sızıntı neden olacak; Bu nedenle, bu durumda, temiz eylem plaka başına bakteriyel inokulumunu eşitliği sağlamak için tüm plakaları üzerinde tekrarlanmalıdır. HiPSC-türetilmiş ıhos bir büyük avantajı onların boyutu. Fareler ve primer insan organoidlerden bağırsak organoids çok daha küçüktür (ölçülen ~ 100 μm ve 100 – 300 μm, sırasıyla²⁷, Versus 250 – 1500 μm hipsc-türetilen ıhos), yani organoidlerin büyük miktarlarda enjeksiyonları yavaş olacaktır. Bu büyük ölçekli enjeksiyon deneylerinin hiPSC türetilen ıhos içinde trialed izin verir. Ayrıca onları postenfeksiyon hasat ve el dpbs içine ihos bunalımları tarafından ıhos luminal içeriğini incelemek mümkündür, onların luminal içeriğini serbest. Mikroenjeksiyon için, yüksek konsantrasyon bakterileri kullanmanızı öneririz. Biz daha düşük konsantrasyonlarda ıhos oluşan ıecs bir yanıt oluşturmak için yeterli değildi bulundu. Ayrıca, daha sonra mikroskobik kullanarak içselleştirilmiş bakterileri bulmak zordu. Inoculums farklı bakteriyel suşları için optimize edilmesi gerekebilir.

Özetle, hipsc-türetilmiş ıhos doğrudan enterik enfeksiyonlara epitelyal tepkisi kesme aleti için umut verici bir model sağlar, ister hücre içi invazif sayıları okuyan, görüntüleme, İHO süper natantlar sitokin düzeylerini ölçme, veya RNA hasat patojenlere maruz kaldıktan sonra transkripsiyonel değişiklikler çalışma. Onların yardımcı programı, insan kısıtlı patojenler için enfeksiyon modelleri kurulması ve belirli hastalıklarla ilgili genetik mutasyonları inceleyerek araştırma kişiselleştirmek için bu teknolojiyi kullanma olanaklarını sömürüyor gelecekte daha da belirgin olacaktır ve uyuşturucu yanıtları.

Materials

2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250-10ML
5 mm glass bottom injection dishes	MatTek corporation	P50G-0-14-F
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634010
Alexa fluor 647 phalloidin	Life Technologies	A22287	Use at 1:1000 concentration
B27 serum-free supplement	Life Technologies	17504044	Stock concentration 50x, final concentration 1x
BMP-4 recombinant human protein	R&D	PHC9534	Stock concentration 10 μg/mL, final concentration 10 ng/mL
Cell recovery solution (cell lifting solution)	BD	354253
CHIR99021	Abcam	ab120890-5mg	Stock concentration 3 mM, final concentration 3 µM
Collagenase, type IV powder	Life Technologies	17104019	Reconstitute at 0.1%
Corning cryogenic vials	Corning	430487
Costar TC treated 24 well culture plates	Corning	CLS3527
DAPI dilactate	Sigma-Aldrich	D9564-10MG	Use at 10 nM concentration
Dulbecco’s PBS (No MgCl2 or CaCl2)	Life Technologies	14190-144
Dulbecco’s PBS (with MgCl2 and CaCl2)	Sigma-Aldrich	D8662-100ML
Epidermal growth factor	R&D	236-EG-200	Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL
Eppendorf TransferMan NK2 (microinjection system)	Eppendorf	920000011
Eppendorf Femtojet express  (microinjection system)	Eppendorf	5248 000.017
Essential 8 Flex medium kit (stem cell culture medium)	Life Technologies	A2858501
EVOS XL imaging system (in-hood imaging system)
Gentamicin	Sigma-Aldrich	G1272-10ML	Stock concentration 10 mg/mL, final concentration 0.1 mg/mL
Goat anti-Salmonella, CSA-1	Insight Biotechnology	02-91-99	Use at 1:20 concentration
HEPES 1 M	Life Technologies	15630056
KnockOut Serum Replacement (setrum replacment)	Gibco	10828010
GlutaMAX supplement (glutamine supplement	ThermoFisher
L-glutamine	Life Technologies	A2916801	Stock concentration 200 mM, final concentration 2 mM
LY294002	Promega UK	V1201	Stock concentration 50 mM, final concentration 10μM
Matrigel, GFR, phenol free (basement membrane matrix)	Corning	356231
MEM non-essential amino acids  solution (100x)	Gibco	11140035
N2 serum-free supplement	Life Technologies	17502048	Stock concentration 100x, final concentration 1x
Penicillin-streptomycin	Life Technologies	15140163	Stock concentration 10,000 U/mL, final concentration 100 U/mL
Phenol red	Sigma-Aldrich	P0290-100ML
Piezo Drill Tip Mouse ICSI, 25° tip angle, 6 µm inner diameter	Eppendorf	5195000087
Prostaglandin E2	Sigma	P0409-1MG	Stock concentration 2.5 mM, final concentration 2.5 mM
Recombinant human FGF basic	R&D	233-FB-025	Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL
Recombinant human IL-22	R&D	6057-NG-100	Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL
Recombinant human Noggin	R&D	6057-NG-100	Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL
Recombinant human R-spondin1	R&D	4645-RS-025	Stock concentration 25 mg/mL, final concentration 500 ng/mL
Recombinant human/mouse/rat Activin A	R&D	338-AC-050	Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL
Recovery cell culture freezing medium (cell freezing medium)	Gibco	12648010
Retinoic acid	Sigma-Aldrich	R2625-50MG	Stock concentration 3μM, final concentration 3mM
RPMI 1640 media with Glutamax supplement (RPMI Medium with L-glutamine supplement)	Life Technologies	61870010
Triton X-100 (cell lysis buffer)	Sigma-Aldrich	RES9690T-A101X	Use at 1% concentration
Versene (EDTA solution)	Life Technologies	15040066
Vitronectin XF	Stemcell Technologies	7180
Y-27632 dihydrochloride monohydrate	Sigma-Aldrich	Y0503-1MG	Stock concentration 3 mM, final concentration 10 mM