Her præsenterer vi en protokol for effektivt at kombinere seriel blok ansigt og fokuseret ion Beam scanning elektronmikroskopi til at målrette et område af interesse. Dette giver mulighed for effektiv søgning, i tre dimensioner, og lokalisering af sjældne begivenheder i et stort synsfelt.
Denne protokol giver mulighed for effektiv og effektiv billeddannelse af celle-eller vævsprøver i tre dimensioner på opløsnings niveauet for elektronmikroskopi. Elektronmikroskopi (EM) har i mange år været en naturlig todimensional teknik. Med fremkomsten af seriel scanning elektronmikroskop Imaging teknikker (Volume EM), ved hjælp af enten en integreret mikrotom eller fokuseret ion stråle til skive derefter se indlejret væv, den tredje dimension bliver let tilgængelig. Seriel blok ansigtsscanning elektronmikroskopi (SBF-SEM) anvender en ultramicrotome, som er omsluttet af SEM-kammeret. Det har evnen til at håndtere store prøver (1.000 μm x 1.000 μm) og billede store synsfelter på små X, Y pixelstørrelse, men er begrænset i Z-dimensionen af diamant kniven. Fokuseret ion Beam SEM (FIB-SEM) er ikke begrænset i 3D-opløsning, (isotropisk voxels på ≤ 5 nm er opnåelige), men synsfeltet er meget mere begrænset. Denne protokol demonstrerer en arbejdsgang for at kombinere de to teknikker for at gøre det muligt at finde individuelle regioner af interesse (Rois) i et stort felt og derefter Imaging den efterfølgende målrettede volumen ved høj isotropisk voxel opløsning. Klargøring af faste celler eller væv er mere krævende for volumen EM teknikker på grund af den ekstra kontrast nødvendig for effektiv signal generering i SEM Imaging. Sådanne protokoller er tidskrævende og arbejdskraftintensive. Denne protokol inkorporerer også mikrobølge assisteret vævs behandling, der letter indtrængningen af reagenser, hvilket reducerer den tid, det kræver at behandle protokollen fra dage til timer.
Denne protokol beskriver en arbejdsgang for effektiv målretning af høj opløsning, tredimensionel elektronmikroskopi (EM) til en specifik interesseregion (ROI). Siden starten i 1930 ‘ erne har EM været en overvejende todimensional teknik. De første offentliggjorte billeder var af hele væv eller celler, men det gav sig hurtigt til sektioner, der blev skåret i hånden ved hjælp af en ultramicrotome og afbildet ved hjælp af et transmissionselektronmikroskop (TEM). TEM producerer mikrografer med meget høj opløsning, hvor selv de mindste cellulære strukturer tydeligt kan skelne. Men den tyndere sektion er nødvendig for væv, der skal afbildet af elektronstrålen gjort oplysninger i Z-dimensionen minimal. Da cellerne er tredimensionale strukturer, måtte interaktioner mellem cellestrukturer og celle flader udledes af begrænsede data. Dette rejste potentialet for fejlfortolkninger, især i strukturer, der var komplekse. Nogle microscopists formået at opnå mere præcise 3D-strukturer ved serie-skæring celler og væv og derefter omhyggeligt rekonstruere dem fra individuelle TEM billeder1. Dette var en meget arbejdskraftintensiv proces, og før fremkomsten af Digital Imaging og computer rendering resultaterne var også vanskeligt at visualisere. I de seneste år to teknikker er blevet indført, som er blevet kollektivt kendt som Volume elektronmikroskopi (Volume EM)2 , der har gjort EM i tre dimensioner tilgængelige for flere laboratorier.
Ideen om at få en stak billeder fra en indlejret blok inde i et elektronmikroskop kan spores tilbage til 1981, da Steve Leighton og Alan Kuzirian byggede en miniature mikrotom og placerede den i kammeret på et scannings elektronmikroskop3 (SBF-SEM) . Denne prototype blev til sidst kopieret og forbedret 23 år senere af Denk og Horstmann4 og efterfølgende kommercialiseret. På nogenlunde samme tid biologiske videnskabsfolk blev opmærksom på en anden teknologi, der primært anvendes i materialevidenskab, den fokuserede ion stråle. Denne teknik bruger en ionstråle af en slags (gallium, plasma) til at fjerne en meget lille mængde overflademateriale fra en prøve (FIB-SEM)5. Begge teknikker ansætte skæring efterfulgt af billeddannelse giver en række billeder, som kan kombineres i en X, Y, Z, stak. Begge teknikker giver 3D-oplysninger, men på forskellige opløsnings skalaer. SBF-SEM er begrænset af de fysiske egenskaber af diamant kniven til skiver ikke tyndere end 50 nm for lange serielle Imaging kørsler; men prøve blokken størrelse, der kan opdeles er stor, op til 1 mm x 1 mm x 1 mm. på grund af den store digitale erhvervelse format af back scattered elektron detektor (32K x 32K pixels), der modtager et signal fra blokken ansigt kan billedpixel størrelser være så små som 1 nm. Dette resulterer i ikke-isotropic voxels, hvor X, Y-dimensionen ofte er mindre end Z. På grund af ionstrålens præcision har FIB-SEM evnen til at indsamle billeder med isotropisk voxels ≤ 5 nm. Men det samlede areal, der kan afbildet er ganske lille. En sammenfattende oversigt over forskellige prøver og volumener, der er inddelt i de to teknikker, er blevet offentliggjort tidligere3.
Vævs forberedelse til volumen EM er vanskeligere end for standard TEM eller SEM, fordi prøverne skal farves for at give tilstrækkelig signal generering i SEM. ofte skal der optimeres ikke kun for den pågældende vævstype, men også for at tilføje kontrast til visse cellulære strukturer til at gøre identifikation og genopbygning lettere. Den protokol, der anvendes her, er baseret på NCMIR standard6. Yderligere farvning betyder normalt yderligere protokol trin. For volumen EM skal standardprotokollerne derfor udvides for at sikre tilstrækkelig tid til, at reagenserne trænger ind i prøven. Mikrobølge assisteret behandling kan reducere den tid, der er nødvendig til farvning fra timer til minutter, og gør prøveforberedelsen af volumen EM mere effektiv7. Denne metode gælder for alle celle-og vævstyper8 og for forskningsspørgsmål, hvor vævs inhomogeniteten gør prøvetagning af et bestemt område væsentligt9.
Når en data stak er opnået det kan justeres og de strukturer af interesse segmenteret fra resten af data og modelleret i 3D. Selv om automatisering af billeddannelse mange skiver af væv har gjort billedet erhvervelse relativt ligetil, processen med at Digital rekonstruere og visualisere data er en tidskrævende opgave. Software til dette formål er endnu ikke integreret eller fuldt automatiseret. Da meget af det tidlige arbejde med Volume EM var rettet mod neurovidenskab, er teknikker til farvning og digitalt segmentering strukturer som axoner forholdsvis langt fremme i forhold til andre celler og organeller. Mens litteraturen om andre ikke-neuronal væv vokser hurtigt, ikke-lineære eller uregelmæssige strukturer kræver mere manuel input.
Ved hjælp af både SBF-SEM og FIB-SEM er en nyttig tilgang til målretning og Imaging specifikke, nonhomogene, væv strukturer ved høj opløsning i 3D. Kombinere det med mikrobølge assisteret vævs behandling, der kraftigt nedsætter den tid, der kræves til prøveforberedelse. Sammen denne arbejdsgang vil gøre genererer høj opløsning isotropisk voxel billed datasæt af fine strukturer en effektiv og hurtigere proces.
Volume elektronmikroskopi er mere udfordrende og tidskrævende end konventionel SEM eller TEM. På grund af behovet for at plette væv eller celler en bloc, skal forarbejdnings trinene være lange nok til at sikre indtrængning af reagenser i hele prøven. Ved hjælp af mikrobølgeenergi til at lette penetration gør for kortere, mere effektiv behandling og forbedrer farvning. Fordi forberedelse til EM er meget strengere end for lys mikroskopi alle opløsninger og reagenser skal være kvalitetskontrol strengt. Ændringer i pH, tonicitet, brug af urene reagenser, og indførelse af forurenende stoffer på grund af dårlig teknik kan alle have skadelige virkninger på det endelige billede.
Volume EM kræver også individuelt skræddersyede protokoller for hver af de forskellige prøvetyper. Pattedyr væv af forskellige typer: planter, enkeltceller såsom gær, trypanosomer, C. elegans, etc., alle har brug for deres egne variationer for at opnå optimale resultater. Fiksering og farvning skal udformes således, at den bevarer den strukturelle integritet og holder prøven så tæt på sin in vivo morfologi som muligt. Fiksering af væv ved fysiologisk temperatur, pH og tonicitet er afgørende for at gøre prøven som livs lignende, som den kan være. Højtryks frysning (HPF) af prøver kan bidrage til at bevare en mere livlignende situation, (eller måske bare give forskellige artefakter), men for andre end celler og meget tynde væv HPF vil mislykkes som glasfri is kan kun genereres i små mængder. Derfor for mange spørgsmål kemisk fiksering er den eneste mulighed. Uanset om fikset er HPF eller kemisk, skal de strukturelle resultater i ethvert EM-eksperiment nøje sammenlignes med lignende resultater fra levende celle-eller vævs Imaging for at se, om de er konsistente. Farvning skal også optimeres under hensyntagen til det specifikke spørgsmål, der skal besvares, og den protokol, der vil blive brugt til visualisering af de digitale billeder.
At have både en SBF-SEM og FIB system i nærheden er en stor fordel i mange eksperimenter. Det store synsfelt og høje X, Y opløsning af SBF-SEM gør at finde individuelle strukturer/celler/begivenheder ligetil og giver en generel rumlig orientering af celler i væv. Desuden er dens evne til at tillade billeddannelse gennem en prøve i Z meget kraftfuld; men rekonstruktioner, der kræver fine geometriske detaljer kan mislykkes eller producere artefakter ved hjælp af denne teknik på grund af den ikke-isotropic voxels det genererer. FIB er begrænset af fysikken i processen til et mindre billedfelt, men dens 3D-opløsning er tilstrækkelig til meget præcise rekonstruktioner. Kombinationen af de to teknikker er ligetil, da prøverne kan flyttes fra SBF-SEM til FIB uden yderligere forarbejdning eller tilberedning. Vi erkender, at brug af SBF-SEM til at søge gennem en prøve for at finde et bestemt område er en meget kostbar brug af et meget mere egnet værktøj. Men evnen til straks at se den nye Block Face og afgøre, om ROI er nået, er en stor fordel. Desuden kan alternativerne ved at bruge serielle semi-tynde (0,5 μm) LM sektioner fjerne små strukturer, før de opdages, og inspicere en blok ved hjælp af enkelt TEM sektioner, der skal skæres, sat på et gitter og derefter ses i en lige så dyrt TEM er ikke så effektiv som den præsenterede metode.
Da der findes mange programmer til at segmentere og gengive data, og behovene i en given struktur ikke kan være bedst tjent med en enkelt applikation, kan ingen standard workflow foreslås. Nogle enkle strukturer kan segmenteret med en tærskel algoritme, hvis de falder inden for meget smalle gråskala værdier. Neuronal strukturer kan semi-automatisk segmenteret ved hjælp af et program som Ilastik11 , men det vil være mindre nyttigt på mere tilfældige eller komplekse formede ORGANELLER såsom er. Microscopy Image browser er et meget fleksibelt program, der kan justere, segmentere og gengive Volume EM-data, men kræver betydelig brugerinteraktion12. Som hovedregel vil den tid, det kræver at visualisere resultaterne digitalt, i høj grad overskride tiden for klargøring af prøven og billeddannelse.
Volumen EM teknikker har åbnet den tredje dimension til ultrastrukturel analyse. Andre metoder til opnåelse af 3D EM har begrænsninger i deres volumen (TEM tomografi), eller deres effektivitet (seriel sektion TEM). Selv om mængde EM-teknikker for det meste er for komplicerede og dyre at gennemføre i de enkelte laboratorier, er antallet af fælles kernefaciliteter, der tilbyder dem, vokset, og antallet af stikprøve typer med succes er steget hastigt. For dem med et specifikt spørgsmål og et bestemt væv er det sandsynligt, at nogen vil være i stand til at tilbyde rådgivning og instruktioner om dens forberedelse og billeddannelse. Volumen EM udstyr kan forbedres til at omfatte kapacitet til at håndtere større prøver i SBF-SEM og evnen til fræsning større ROIs med FIB. Software, der er i stand til at segmentere ud strukturer af interesse i en mere automatiseret måde vil langt forenkle processen med at analysere data og forbedringer i computing hastighed vil reducere den nødvendige tid til at gøre det. På trods af de nuværende begrænsninger er Volume EM stadig et nyttigt værktøj, og kombinationen af SBF-SEM og FIB-SEM giver en effektiv arbejdsgang til at identificere sjældne hændelser og afbilde dem ved høj opløsning.
The authors have nothing to disclose.
Udstyret til volumen EM blev leveret af et gavmildt tilskud fra den flamske regering.
3View 2XP | Gatan | NA | In chamber ultramicrotome for SBFI |
Cacodylate buffer 0.2M solution | EM Sciences | 11652 | |
Conductive epoxy resin (circuit works) | RS components | 496-265 | |
Diatome Histo 4.0mm diamond knife | EM Sciences | 40-HIS | |
Digitizing tablet | Wacom | DTV-1200W | No longer available |
Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 120.094 | |
Flat Embedding Mold | EM Sciences | 70900 | |
Gluteraldehyde 25% solution | EM Sciences | 16220 | |
High MW Weight Tannic Acid | EM Sciences | 21700 | |
Lead Citrate | Sigma-Aldrich | 22861 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | 746398 | |
Osmium Tetroxide 4% solution | EM Sciences | 19170 | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
Pelco Biowave Pro + | Ted Pella | 36700 | |
Potassium Ferrocyanide | Sigma-Aldrich | P3289 | |
Quorum Q150T ES sputter coater | Quorum Technologies | 27645 | |
Reichert-Jung Ultracut ultramicrotome | NA | NA | No longer available |
Sodium Cacodylate 0.2M | EM Sciences | 11653 | |
Spurrs Resin kit | EM Sciences | 14300 | |
Uranyl Acetate | EM Sciences | 22400 |