Her presenterer vi en protokoll for effektivt kombinere seriell blokk ansikt og fokusert ion Beam skanning elektron mikroskopi å målrette et område av interesse. Dette gjør det mulig for effektiv søking, i tre dimensjoner, og finne sjeldne hendelser i et stort synsfelt.
Denne protokollen gjør det mulig for effektiv avbildning av celle-eller vevsprøver i tre dimensjoner ved oppløsnings nivået av elektron mikroskopi. For mange år elektron mikroskopi (EM) har forblitt en iboende to-dimensjonal teknikk. Med bruk av seriell skanning elektronmikroskop Imaging teknikker (volum EM), ved hjelp av enten en integrert mikrotomen eller fokusert ion strålen å skive deretter vise innebygd vev, den tredje dimensjonen blir lett tilgjengelig. Seriell blokk ansikt skanning elektron mikroskopi (SBF-SEM) bruker en ultramicrotome vedlagt i SEM kammeret. Den har evnen til å håndtere store prøver (1 000 μm x 1 000 μm) og bilde store felt av syn på små X, Y pixel størrelse, men er begrenset i Z-dimensjonen av diamant kniven. Fokusert ion strålen SEM (LØGN-SEM) er ikke begrenset i 3D-oppløsning, (isotropic voxels av ≤ 5 NM er oppnåelig), men synsfeltet er mye mer begrenset. Denne protokollen demonstrerer en arbeidsflyt for å kombinere de to teknikkene for å tillate å finne individuelle områder av interesse (ROIs) i et stort felt, og deretter Imaging den påfølgende målrettede volum ved høy isotropic Voxel oppløsning. Forbereder faste celler eller vev er mer krevende for volum EM teknikker på grunn av ekstra kontrasterende nødvendig for effektiv signal generasjon i SEM Imaging. Slike protokoller er tidkrevende og arbeidsintensiv. Denne protokollen inneholder også mikrobølgeovn assistert vev prosessering tilrettelegge inntrengning av reagenser, som reduserer tiden som trengs for behandling protokollen fra dager til timer.
Denne protokollen beskriver en arbeidsflyt for effektiv målretting av høyoppløselige, tredimensjonale elektron mikroskopi (EM) til en bestemt region av interesse (ROI). Siden begynnelsen på 1930-tallet, har EM vært en hovedsakelig to-dimensjonal teknikk. De første publiserte bildene var av hele vev eller celler, men som snart banet vei for seksjoner som ble kuttet for hånd ved hjelp av en ultramicrotome og avbildet ved hjelp av et overførings elektronmikroskop (TEM). TEM produserer svært høyoppløselige micrographs der selv de minste cellulære strukturene er klart merkes. Men tynnhet av delen er nødvendig for vevet å bli avbildet av elektron strålen gjort informasjon i Z dimensjon minimal. Ettersom celler er tredimensjonale strukturer, måtte interaksjoner mellom celle strukturer og celle overflater utledes fra begrensede data. Dette hevet potensialet for feil tolkning, spesielt i strukturer som var komplekse. Noen microscopists klarte å få mer nøyaktige 3D-strukturer ved seriell-skjæring celler og vev og deretter møysommelig rekonstruere dem fra individuelle TEM bilder1. Dette var en svært arbeidskrevende prosess og før advent av digital bildebehandling og datamaskinen rendering resultatene var også vanskelig å visualisere. I de senere årene to teknikker har blitt innført som har blitt kollektivt kjent som Volume Electron mikroskopi (volum EM)2 som har gjort dem i tre dimensjoner tilgjengelig for flere laboratorier.
Ideen om å få en stabel med bilder fra en innebygd blokk inne i et elektronmikroskop kan spores tilbake til 1981 når Steve Leighton og Alan Kuzirian bygde en miniatyr mikrotomen og plasserte den i kammeret til en skanning elektronmikroskop3 (SBF-SEM) . Denne prototypen ble til slutt kopiert og forbedret 23 år senere av Denk og Horstmann4 og deretter kommersialisert. På omtrent samme tid biologiske forskere ble oppmerksom på en annen teknologi som brukes hovedsakelig i materialer vitenskap, fokusert ion strålen. Denne teknikken bruker en ion stråle av noe slag (Gallium, plasma) for å fjerne en svært liten mengde av overflate materiale fra en prøve (LØGN-SEM)5. Begge teknikkene benytter snitting etterfulgt av Imaging gir en rekke bilder som kan kombineres til en X, Y, Z, stack. Begge teknikkene gir 3D-informasjon, men med forskjellige oppløsnings vekter. SBF-SEM er begrenset av de fysiske egenskapene til diamant kniven til skiver ikke tynnere enn 50 NM for lang seriell imaging går; men størrelsen på prøveblokken som kan delt, er stor, opptil 1 mm x 1 mm x 1 mm. på grunn av den store digitale oppkjøpet format av ryggen spredt elektron detektor (32k x 32k piksler) som mottar et signal fra blokken ansiktet kan bilde piksel størrelser være så små som 1 NM. Dette resulterer i ikke-isotropic voxels der X-, Y-dimensjonen ofte er mindre enn Z. På grunn av presisjonen av ion strålen, liten LØGN-SEM har evnen til å samle bilder med isotropic voxels ≤ 5 NM. Imidlertid er det totale arealet som kan avbildet ganske liten. En oppsummering tabell over ulike prøver og volumer avbildet med de to teknikkene har blitt publisert tidligere3.
Vevs forberedelser for volum EM er vanskeligere enn for standard TEM eller SEM fordi prøvene må være farget for å gi tilstrekkelig signal generasjon i SEM. ofte må farging optimaliseres ikke bare for den spesielle vevs typen, men også for å legge til kontrast til visse cellulære strukturer for å gjøre identifisering og gjenoppbygging enklere. Protokollen som brukes her er basert på NCMIR standard6. Ytterligere flekker betyr vanligvis flere protokoll trinn. Således for volum EM, standardprotokoller må utvides for å sikre tilstrekkelig tid for reagenser å trenge prøven. Mikrobølgeovn assistert prosessering kan redusere tiden som trengs for farging fra timer til minutter og gjør volum EM prøve forberedelser mer effektiv7. Denne metoden gjelder for alle celle-og vevstyper8 og til forskning spørsmål der inhomogeneity av vevet gjør prøvetaking av et bestemt område avgjørende9.
Når en data stabel er innhentet den kan justeres og strukturer av interesse segmentert fra resten av data og modellert i 3D. Selv om automatisering av Imaging mange skiver av vev har gjort bildet oppkjøpet relativt grei, er prosessen med digitalt rekonstruere og visualisere dataene en tidkrevende oppgave. Programvare for dette formålet er ennå ikke integrert eller helautomatisk. Siden mye av det tidlige arbeidet med volum EM var rettet mot nevrovitenskap, teknikker for farging og digitalt segmentere strukturer som axons er ganske langt avansert i forhold til andre celler og organeller. Mens litteraturen om andre ikke-neuronal vev vokser raskt, ikke-lineære eller uregelmessige strukturer krever mer manuell input.
Bruke både SBF-SEM og liten LØGN-SEM er en nyttig tilnærming for målretting og Imaging spesifikke, nonhomogeneous, vev strukturer i høy oppløsning i 3D. Kombinere det med mikrobølgeovn assistert vev behandling som vesentlig reduserer tiden som trengs for prøven forberedelse. Sammen denne arbeidsflyten vil gjøre generere høyoppløselig isotropic Voxel bildedata sett av fine strukturer en effektiv og raskere prosess.
Volume Electron mikroskopi er mer utfordrende og tidkrevende enn konvensjonelle SEM eller TEM. På grunn av behovet for å flekk vev eller celler en blokk, må behandlingstrinnene være lange nok til å sikre inntrengning av reagenser gjennom hele prøven. Ved hjelp av mikrobølgeovn energi for å lette penetrasjon gir kortere, mer effektiv prosessering og forbedrer farging. Fordi forberedelsene til EM er mye strengere enn for lys mikroskopi, må alle oppløsninger og reagenser være kvalitets kontrollerte. Endringer i pH, tonisitet, bruk av urene reagenser, og innføring av forurensninger på grunn av dårlig teknikk kan alle ha skadelige effekter på det endelige bildet.
Volume EM krever også individuelt tilpassede protokoller for hver forskjellige utvalgstype. Pattedyr vev av forskjellige typer: planter, enkeltceller som gjær, trypanosomes, C. elegans, etc., alle trenger sine egne variasjoner for å oppnå optimale resultater. Fiksering og farging må utformes for å bevare strukturell integritet og holde prøven så nær sin in vivo morfologi som mulig. Fiksering av vev ved fysiologisk temperatur, pH og tonisitet er avgjørende for å gjøre prøven som livet-lignende som det kan være. Høytrykks frysing (HPF) av prøvene kan bidra til å bevare en mer liv-lignende situasjon, (eller kanskje bare gi forskjellige gjenstander), men for andre enn celler og svært tynt vev HPF vil mislykkes som glasslegemet isen kan bare genereres i små volumer. Derfor for mange spørsmål kjemisk fiksering er det eneste alternativet. Uansett om fiksering er HPF eller kjemisk, i alle EM eksperimentere de strukturelle resultatene må nøye sammenlignet med lignende resultater fra levende celle eller vev Imaging å se om de er konsekvente. Farging må også optimaliseres mens vurderer konkrete spørsmål som må besvares og protokollen som skal brukes til visualisering av digitale bilder.
Å ha både en SBF-SEM og liten LØGN system i umiddelbar nærhet er en stor fordel i mange eksperimenter. Det store synsfelt og høy X, Y oppløsning av SBF-SEM gjør finne individuelle strukturer/celler/hendelser grei og gir en samlet romlig orientering av celler i vev. I tillegg er dens evne til å tillate Imaging gjennom en prøve i Z svært kraftig; Imidlertid, rekonstruksjoner det forlange fin geometrisk detaljen kanne Fail eller tilvirke artefakter benytter denne teknikk på grunn av det ingen-isotropic voxels den utvikler. Den liten LØGN er begrenset av fysikken i prosessen til en mindre tenkelig felt, men dens 3D-oppløsning er tilstrekkelig for svært nøyaktig rekonstruksjoner. Kombinere de to teknikkene er grei som prøver kan flytte fra SBF-SEM til LØGN uten videre bearbeiding eller forberedelser. Vi erkjenner at bruk av SBF-SEM for å søke gjennom en prøve for å finne et bestemt område er en svært kostbar bruk av en mye mer kapabel verktøy. Men muligheten til å umiddelbart se den nye blockface og avgjøre om AVKASTNINGEN er nådd er en stor fordel. I tillegg alternativene for å bruke seriell semi-tynne (0,5 μm) LM seksjoner kan fjerne små strukturer før de oppdages, og inspisere en blokk med enkelt TEM seksjoner som må kuttes, sette på et rutenett og deretter sett i en like dyre TEM er ikke så effektiv som den metoden som presenteres.
Fordi det finnes mange programmer for å segmentere og gjengi dataene, og behovene til en gitt struktur er kanskje ikke best tjent med et enkelt program, kan ingen standardarbeidsflyt foreslås. Noen enkle strukturer kan være segmentert med en terskelverdi algoritme hvis de faller innenfor svært smale gråskala verdier. Neuronal strukturer kan semi-automatisk segmentert ved hjelp av et program som Ilastik11 , men det vil være mindre nyttig på mer tilfeldig eller komplisert formet ORGANELLER som eh. Mikroskopi image Browser er et svært fleksibelt program som kan justere, segmentere og gjengi volum EM data, men krever betydelig brukermedvirkning12. Som en generell regel hvor mye tid som trengs for å digitalt visualisere resultatene vil i stor grad overstige tiden for å forberede prøven og Imaging.
Volume EM teknikker har åpnet opp den tredje dimensjonen til ultrastructural analyse. Andre metoder for å få 3D EM har begrensninger i sitt volum (TEM tomografi), eller deres effektivitet (seriell del TEM). Selv for det meste volum EM teknikker er for komplisert og kostbart å bli implementert i individuelle laboratorier, antall delte kjernen fasiliteter som tilbyr dem har vokst og antall prøvetyper vellykket avbildet har økt raskt. For de med et bestemt spørsmål og et bestemt vev er det sannsynlig at noen vil være i stand til å gi råd og instruksjoner om sin forberedelse og bildebehandling. Volume EM utstyr kan forbedres til å omfatte kapasitet til å håndtere større prøver i SBF-SEM og evnen til fresing større ROIs med liten LØGN. Programvare som er i stand til å segmentere ut strukturer av interesse i en mer automatisert måte vil vesentlig forenkle prosessen med å analysere data og forbedringer i databehandling hastighet vil redusere tiden det tar å gjøre det. Til tross for sin nåværende begrensninger, er volum EM fortsatt et nyttig verktøy og kombinere SBF-SEM og liten LØGN-SEM gir en effektiv arbeidsflyt for å identifisere sjeldne hendelser og Imaging dem i høy oppløsning.
The authors have nothing to disclose.
Utstyret for volum EM ble gitt av en generøs bevilgning fra regjeringen i Flandern.
3View 2XP | Gatan | NA | In chamber ultramicrotome for SBFI |
Cacodylate buffer 0.2M solution | EM Sciences | 11652 | |
Conductive epoxy resin (circuit works) | RS components | 496-265 | |
Diatome Histo 4.0mm diamond knife | EM Sciences | 40-HIS | |
Digitizing tablet | Wacom | DTV-1200W | No longer available |
Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 120.094 | |
Flat Embedding Mold | EM Sciences | 70900 | |
Gluteraldehyde 25% solution | EM Sciences | 16220 | |
High MW Weight Tannic Acid | EM Sciences | 21700 | |
Lead Citrate | Sigma-Aldrich | 22861 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | 746398 | |
Osmium Tetroxide 4% solution | EM Sciences | 19170 | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
Pelco Biowave Pro + | Ted Pella | 36700 | |
Potassium Ferrocyanide | Sigma-Aldrich | P3289 | |
Quorum Q150T ES sputter coater | Quorum Technologies | 27645 | |
Reichert-Jung Ultracut ultramicrotome | NA | NA | No longer available |
Sodium Cacodylate 0.2M | EM Sciences | 11653 | |
Spurrs Resin kit | EM Sciences | 14300 | |
Uranyl Acetate | EM Sciences | 22400 |