Generation av 3-D kollagen-baserade Hydrogels att analysera Axonal tillväxt och beteende under nerv systemet utveckling
Summary
Här ger vi en metod för att analysera beteendet hos växande axoner i 3D-matriser, imitera deras naturliga utveckling.
Abstract
Detta protokoll använder naturliga typ I kollagen för att generera tredimensionell (3-D) hydrogel för övervakning och analys av axonal tillväxt. Protokollet är centrerad på odling av små bitar av embryonal eller tidig postnatal gnagare hjärnor inuti en 3-D hydrogel bildas av råtta svans senan-derived typ I kollagen med specifik porositet. Vävnad bitar är odlade inuti Hydro gel och konfronteras med specifika hjärnfragment eller genetiskt modifierade cell aggregat för att producera och utsöndra molekyler som lämpar sig för att skapa en gradient inuti den porösa matrisen. Stegen i det här protokollet är enkla och reproducerbara men innehåller kritiska steg som ska övervägas noggrant under dess utveckling. Dessutom kan beteendet hos växande axoner övervakas och analyseras direkt med hjälp av ett fas-kontrast Mikroskop eller mono/multiphoton fluorescens Mikroskop efter fixering av immuncytokemiska metoder.
Introduction
Neuronala axoner, slutar i axonal tillväxt koner, migrera långa sträckor genom extracellulär matrix (ECM) av embryot över specifika vägar för att nå sina lämpliga mål. Tillväxten konen är den distala delen av axon och det är specialiserat att känna den fysiska och molekyl ära miljön i cellen1,2. Ur ett molekylärt perspektiv styrs tillväxts kottar av minst fyra olika molekyl ära mekanismer: kontakt attraktion, chemoattraction, kontakt med motgång, och chemorepulser utlöst av olika axonala väglednings signaler3,4 , 5 den femte , 6. kontaktmedierade processer kan delvis övervakas i tvådimensionella (2D) kulturer på mikromönstrade substrat (t. ex. med ränder7,8 eller fläckar9 som innehåller molekylerna). Axoner kan dock navigera till sitt mål på ett icke-diffusivt sätt genom att känna av flera attraktiva och motbjudande molekyler från guidepost celler i miljön4,5,10. Här beskriver vi en enkel metod för 3-D kultur för att kontrol lera om en utsöndras molekyl inducerar chemorepulsive eller chemoattraktiv effekter på att utveckla axoner.
De tidigaste studierna syftade till att fastställa effekterna av axon vägledning Cues används explant kulturer i tredimensionella (3-D) matriser för att generera gradienter simulera in vivo villkor11,12. Detta tillvägagångs sätt, tillsammans med in vivo-experiment, möjliggjorde identifiering av fyra större familjer med vägledning: netrins, slits, semaphorins och ephrins4,5,6. Dessa molekyl ära signaler och andra faktorer13 är integrerade av de växande axonerna, utlöser dynamiken i adhesionskomplex och transducing mekaniska krafter via cytoskelettet14,15,16. För att generera molekyl ära gradienter i 3-D kulturer för axonal navigation, Ban brytande forskare använde plasmakoagel substrat17, som också användes för organotypisk skiva preparat18. Men i 1958, ett nytt protokoll för att generera 3-D kollagen vävnadsinväxt rapporterades för att studera med maximow ́s enheter19, en kultur plattform, som används i flera studier som lämpar sig för mikroskopiska observationer20. En annan pionjär studie rapporterade kollagen gel som ett verktyg för att bädda in mänskliga fibroblaster för att studera differentiering av fibroblaster till myofibroblaster i sårläkning processer21. Parallellt, Lumsden och Davies tillämpat kollagen från bovint dermis att analysera den förmodade effekten av nerv tillväxtfaktor (NGF) på väg LED ande av sensoriska nerv fibrer22. Med utvecklingen av nya kulturplattformar (t. ex. multi-well tallrikar) av olika företag och laboratorier, var kollagen kulturer anpassade till dessa nya enheter6,23,24,25 ,26. Parallellt gjordes ett utdrag av ECM-material från Engelbreth-Holm-Svärmorcellslinjen som var kommersiellt tillgängligt för att utvidga dessa studier27.
Nyligen har flera protokoll utvecklats för att generera molekyl ära gradienter med förmodade roller i Axon vägledning med hjälp av 3-D vävnadsinväxt (t. ex. kollagen, fibrin, etc.) 28. Alternativt kan kandidat molekylen immobiliseras vid olika koncentrationer i en porös matris (t. ex. NGF29) eller genereras genom odling i en liten region av 3-D Hydro gel cell aggregat som utsöndrar molekylen för att generera en radiell lutning4,23,24,25,26. Den sista möjligheten kommer att förklaras i detta protokoll.
Det förfarande som presenteras här är en enkel, snabb och mycket reproducerbar metod baserad på analys av axonal tillväxt i 3-D hydrogel kulturer av embryonala mus hjärna. I jämförelse med andra metoder är protokollet väl lämpat för icke-utbildade forskare och kan utvecklas fullt ut efter en kort utbildning (1-2 veckor). I detta protokoll, isolerar vi först kollagen från vuxna råtta svansar för att ytterligare generera 3-D matriser där genetiskt modifierade cell aggregat odlas framför den embryoneuronala vävnaden. Dessa cell aggregat bildar radiella kemiska gradienter av en kandidat molekyl som framkallar ett svar för de växande axonerna. Slutligen, utvärdering av effekterna av molekylen på växande axoner kan lätt utföras med hjälp av en fas kontrast mikroskopi eller, alternativt, immuncytochemical metoder.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tillväxten av att utveckla axoner är främst invasiv och inkluderar ECM nedbrytning och remodeling. Med hjälp av det förfarande som presenteras här, forskare kan få en homogen 3-D matris som bildas av den naturliga typ I kollagen där axoner (eller celler) kan reagera på en kemisk gradient utsöndras av genetiskt modifierade celler som de gör in vivo. Olika axonal svar på lutningar av attraktiva eller hämmande signaler (protein, lipider, etc.) kan lätt jämföras med specifik kontroll (mock transfekterade cell…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar Tom Yohannan för den redaktionella rådgivningen och M. Segura-Feliu för den tekniska hjälpen. Detta arbete finansierades av CERCA-programmet och av kommissionen för universitet och forskning vid institutionen för innovation, universitet och företag vid Generalitat de Catalunya (SGR2017-648). Detta arbete finansierades av det spanska ministeriet för forskning, innovation och universitet (MEICO) genom BFU2015-67777-R och och RTI2018-099773-B-100, den spanska Prion Network (PRIONET Spanien AGL2017-90665-REDT), och Institutet Carlos III, CIBERNED ( PRY-2018-2).
Materials
| Material | |||
| 3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets (DAB) | Sigma | D5905 | |
| Adult Sprague-Dawley rats (8 to 9 weeks old) | Criffa-Credo, Lyon, France | ||
| Avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) | Vector Labs | PK-4000 | |
| B27 serum-free supplement 50x | Invitrogen | 17504-044 | |
| Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| cDNA plasmid vectors | |||
| COS1 cell lines | ATTC | CRL-1570 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | 16325 | |
| D-(+)-glucose (45% solution in water) for complete Neurobasal medium | Sigma | G8769 | |
| D-MEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium 1x ) for COS1 culture medium | Invitrogen | 41966-029 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline 10x (without Ca2+ and Mg2+) (D-PBS) for cultures | Invitrogen | 14200 | |
| Ethanol | merck | 108543 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid dihydrate disodium salt (EDTA) | Sigma | E5134 | |
| Fluorescence mounting media (e.g., Fluoromount-G or similar) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 17984-25 | |
| Gelatin powder | Sigma | G1890 | |
| Glacial acetic acid (Panreac, cat. no. 211008) | Panreac | 211008 | |
| Hank’s balanced salt solution | Invitrogen | 24020083 | |
| Heat-inactivated foetal bovine serum | Invitrogen | 10108-165 | |
| Heat-inactivated horse serum | Invitrogen | 26050-088 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2, 32 to 33% in water) | Sigma | 316989 | |
| L-glutamine 200 mM solution (100x) for complete Neurobasal and COS1 medium | Invitrogen | 25030-024 | |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Invitrogen | 11668-019 | |
| Mice pregnant female (embryonic day 12.5 to 16.5; E12.5-16.5) | Criffa-Credo, Lyon, France | ||
| Modified Minimum Essential Medium Eagle (MEM) | Invitrogen | 11012-044 | |
| Monoclonal antibody against class III β-tubulin (clone TUJ-1) | Biolegend | 801201 | |
| N-2 supplement 100x | Invitrogen | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 1,040,051,000 | |
| Penicillin/streptomycin solution 100x | Invitrogen | 15140-22 | |
| Phosphate buffered saline 10x (PBS) for immunocytochemistry | Invitrogen | AM9624 | |
| Secondary antibody: biotinylated horse anti-mouse | Vector Labs | BA-2000 | |
| Serum-free medium (Opti-MEM) | Invitrogen | 11058-021 | |
| Sodium azide | Panreac | 162712 | |
| Sodium bicarbonate solution 7.5% | Invitrogen | 25080-094 | |
| Sterile culture grade H2O | Sigma | W3500 | |
| TritonTM X-100 | Sigma | X100 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Trypsin-EDTA (Trypsin (0.05% (wt/vol) with EDTA (1x) | Invitrogen | 25300-054 | |
| Equipment | |||
| 1 large and 1 small curved scissors for dissection | Fine tools Instruments or similar | ||
| 1.5-ml conical centrifuge tubes | Eppendorf or similar | ||
| 15-ml conical centrifuge tubes | Corning or similar | ||
| 2 haemostats | Fine tools Instruments or similar | ||
| 2 small straight dissecting scissors | Fine tools Instruments or similar | ||
| 200-ml centrifuge tubes for centrifugation | Nalgene or similar | ||
| 200-ml sterile glass conical flasks | |||
| 2-litre glass beaker | |||
| 4- and 6-well culture plates | Nunc | 176740 and 140675 | |
| Automatic pipette pumps and disposable 10 ml and 25 ml filter-containing sterile plastic pipettes. | Gilson, Brand, Eppendorf or similar | ||
| Automatic pipettes, sterile filter tips and current sterile tips | Gilson, Eppendorf or similar | ||
| Bench top microcentrifuge with angle fixed rotor | Eppendorf, Beckman Coulter or similar | ||
| Bench top refrigerated centrifuge with swing-bucket rotor (with 1.5, 15 and 50 ml tube adaptors) | Eppendorf, Beckman Coulter or similar | ||
| Cell culture incubator at 37 ºC, 5% CO2 and 95% air | |||
| Dialysis tubing cellulose membrane | Sigma | D9402 | |
| Dialysis tubing closures | Sigma | Z37101-7 | |
| Disposable glass pipettes | |||
| Dissecting microscope with dark field optics | Olympus SZ51 or similar | ||
| High-speed refrigerated Beckman Coulter centrifuge or similar with angle fixed rotor | |||
| Laminar flow hood | |||
| Large 100-mm, 60-mm and small 35-mm Ø cell culture dishes | Nunc | 150679 , 150288 and 150318, respectively | |
| Magnetic stirrer and magnetic spin bars | IKA or similar | ||
| McIlwain tissue chopper | Mickle Laboratory Engineering | ||
| One pair of fine straight forceps and one pair of curved forceps | Fine tools Instruments or similar | ||
| Razor blades for the tissue chopper | |||
| Scalpels (number 15 and 11) | |||
| Two pairs of fine spatulas for transferring collagen and tissue pieces | Fine tools Instruments or similar | ||
Referências
- Ramón y Cajal, S. . Les nouvelles idées sur la structure du système nerveux chez l’homme et chez les vertébrés. , (1894).
- Ramón y Cajal, S. . Nuevo concepto de la histología de los centros nerviosos. , (1893).
- Marin, O., Valiente, M., Ge, X., Tsai, L. H. Guiding neuronal cell migrations. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (2), 001834 (2010).
- Tessier-Lavigne, M., Goodman, C. S. The molecular biology of axon guidance. Science. 274 (5290), 1123-1133 (1996).
- Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).
- Kolodkin, A. L., Tessier-Lavigne, M. Mechanisms and molecules of neuronal wiring: a primer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (6), 001727 (2011).
- Rosentreter, S. M., et al. Response of retinal ganglion cell axons to striped linear gradients of repellent guidance molecules. Journal of Neurobiology. 37 (4), 541-562 (1998).
- Knoll, B., Weinl, C., Nordheim, A., Bonhoeffer, F. Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration. Nature Protocols. 2 (5), 1216-1224 (2007).
- von Philipsborn, A. C., et al. Growth cone navigation in substrate-bound ephrin gradients. Development. 133 (13), 2487-2495 (2006).
- Chen, H., He, Z., Tessier-Lavigne, M. Axon guidance mechanisms: semaphorins as simultaneous repellents and anti-repellents. Nature Neuroscience. 1 (6), 436-439 (1998).
- Jessell, T. M., Sanes, J. R. Development. The decade of the developing brain. Current Opinion in Neurobiology. 10 (5), 599-611 (2000).
- Serafini, T., et al. The netrins define a family of axon outgrowth-promoting proteins homologous to C. elegans UNC-6. Cell. 78 (3), 409-424 (1994).
- Charron, F., Tessier-Lavigne, M. Novel brain wiring functions for classical morphogens: a role as graded positional cues in axon guidance. Development. 132 (10), 2251-2262 (2005).
- Fournier, M. F., Sauser, R., Ambrosi, D., Meister, J. J., Verkhovsky, A. B. Force transmission in migrating cells. Journal of Cell Biology. 188 (2), 287-297 (2010).
- Dent, E. W., Gertler, F. B. Cytoskeletal dynamics and transport in growth cone motility and axon guidance. Neuron. 40 (2), 209-227 (2003).
- Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (5), 332-343 (2009).
- Castellani, V. B. . Protocols for Neuronal Cell Culture. , (2001).
- Gahwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
- Bornstein, M. B. Reconstituted rattail collagen used as substrate for tissue cultures on coverslips in Maximow slides and roller tubes. Laboratory Investigation. 7 (2), 134-137 (1958).
- Billings-Gagliardi, S., Wolf, M. K. A simple method for examining organotypic CNS cultures with Nomarski optics. In Vitro. 13 (6), 371-377 (1977).
- Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proceedings of the National Academy of Science. 76 (3), 1274-1278 (1979).
- Lumsden, A. G., Davies, A. M. Earliest sensory nerve fibres are guided to peripheral targets by attractants other than nerve growth factor. Nature. 306 (5945), 786-788 (1983).
- Chedotal, A., et al. Semaphorins III and IV repel hippocampal axons via two distinct receptors. Development. 125 (21), 4313-4323 (1998).
- Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R., Tessier-Lavigne, M. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78 (3), 425-435 (1994).
- Klein, R. Eph/ephrin signaling in morphogenesis, neural development and plasticity. Current Opinion in Cell Biology. 16 (5), 580-589 (2004).
- Wang, K. H., et al. Biochemical purification of a mammalian slit protein as a positive regulator of sensory axon elongation and branching. Cell. 96 (6), 771-784 (1999).
- Emonard, H., Grimaud, J. A., Nusgens, B., Lapiere, C. M., Foidart, J. M. Reconstituted basement-membrane matrix modulates fibroblast activities in vitro. Journal of Cell Physiology. 133 (1), 95-102 (1987).
- Knapp, D. M., Helou, E. F., Tranquillo, R. T. A fibrin or collagen gel assay for tissue cell chemotaxis: assessment of fibroblast chemotaxis to GRGDSP. Experimental Cell Research. 247 (2), 543-553 (1999).
- Kapur, T. A., Shoichet, M. S. Immobilized concentration gradients of nerve growth factor guide neurite outgrowth. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 68 (2), 235-243 (2004).
- Torres-Espin, A., Santos, D., Gonzalez-Perez, F., del Valle, J., Navarro, X. Neurite-J: an image-J plug-in for axonal growth analysis in organotypic cultures. Journal of Neuroscience Methods. 236, 26-39 (2014).
- Balestrini, J. L., et al. Comparative biology of decellularized lung matrix: Implications of species mismatch in regenerative medicine. Biomaterials. 102, 220-230 (2016).
- Qian, J., et al. Kinetic Analysis of the Digestion of Bovine Type I Collagen Telopeptides with Porcine Pepsin. Journal of Food Science. 81 (1), 27-34 (2016).
- Eyre, D. R., Weis, M., Hudson, D. M., Wu, J. J., Kim, L. A novel 3-hydroxyproline (3Hyp)-rich motif marks the triple-helical C terminus of tendon type I collagen. Journal of Biological Chemistry. 286 (10), 7732-7736 (2011).
- Garnotel, R., et al. Human blood monocytes interact with type I collagen through alpha x beta 2 integrin (CD11c-CD18, gp150-95). Journal of Immunology. 164 (11), 5928-5934 (2000).
- Montolio, M., et al. A semaphorin 3A inhibitor blocks axonal chemorepulsion and enhances axon regeneration. Chemistry and Biology. 16 (7), 691-701 (2009).
- Garcia-Gareta, E. Collagen gels and the ‘Bornstein legacy’: from a substrate for tissue culture to cell culture systems and biomaterials for tissue regeneration. Experimental Dermatology. 23 (7), 473-474 (2014).
