نموذج Xenograft غير متجانس ة من سرطان البنكرياس المستمدة من المريض باستخدام يرقات سمك الحمار الوحشي كمضيفين للتقييم المقارن للأدوية
Summary
يصف هذا البروتوكول إجراءات التحسين في نموذج xenograft الورم المزدوج القائم على الفيروسات باستخدام سمك الحمار الوحشي اليرقات كمضيفين. هذا النموذج xenograft غير متجانسة يحاكي تكوين الأنسجة من سرطان البنكرياس microenvironment في الجسم الحي، ويعمل كأداة أكثر دقة لتقييم استجابات المخدرات في zPDX شخصية (حمار وحشي المريض المستمدة xenograft) النماذج.
Abstract
يُتعتبر الشُوّة السرطان المستمدة من المريض (PDX) وxenograft (CDX) المستمدة من الخلايا من التقنيات الهامة للتقييم قبل السريري، والتوجيه الدوائي، والبحوث الأساسية للسرطان. أجيال من نماذج PDX في الفئران المضيفة التقليدية تستغرق وقتاطويلا وتعمل فقط لنسبة صغيرة من العينات. في الآونة الأخيرة، ظهرت حمار وحشي PDX (zPDX) كنظام مضيف فريد من نوعه، مع خصائص صغيرة النطاق وكفاءة عالية. هنا، نقوم بوصف منهجية محسنة لتوليد نموذج xenograft الورم المزدوج المسمى الفلورة لتقييم العلاج الكيميائي المقارن في نماذج zPDX. تم إثراء الخلايا السرطانية والخلايا الليفية من أنسجة سرطان البنكرياس التي تم حصادها حديثًا أو المجمدة في ظروف ثقافية مختلفة. وقد وصفت كل من مجموعات الخلايا من قبل lentivirus التعبير عن البروتينات الفلورية الخضراء أو الحمراء، فضلا عن الجينات المضادة للأبوبوتوس BCL2L1. وكانت الخلايا المتحولة مختلطة مسبقاً وحقنت بالمشاركة في أسماك الحمار الوحشي لليرقات dpf 2 التي ولدت بعد ذلك في متوسط E3 المعدل عند 32 درجة مئوية. تم علاج نماذج xenograft عن طريق أدوية العلاج الكيميائي و / أو مثبطات BCL2L1، وتم التحقيق في حيوي كل من الخلايا السرطانية والخلايا الليفية في وقت واحد. وباختصار، يسمح هذا البروتوكول للباحثين لتوليد بسرعة كمية كبيرة من نماذج zPDX مع بيئة صغيرة الورم غير متجانسة ويوفر نافذة مراقبة أطول وكمية أكثر دقة في تقييم كفاءة المرشحين المخدرات.
Introduction
الأورام الدقيقة تهدف إلى إيجاد الاستراتيجياتالعلاجية الأكثر فائدة للمريض الفردي 1. حاليا، العديد من النماذج ما قبل السريرية مثلفي المختبر الثقافة الأولية، في المختبر الثقافة العضوية 2، وxenografts المستمدة من المريض (PDX) في الفئران قبل أو بعد الثقافة العضوية المقترحة لتشخيص وفحص / تقييم إمكانات الخيارات العلاجية3. نموذج PDX التي تم إنشاؤها عن طريق حقن خلايا السرطان الأولية البشرية في الفئران المناعية للخطر، هي واحدة من الأدوات الواعدة لفحص المخدرات شخصية في الأورام السريرية3،4. على عكس خط الخلايا المستزرعة في المختبر، عادة ما تحافظ نماذج PDX على سلامة وتباين بيئة الورم في الجسم الحي، وتحاكي بشكل أفضل التنوع والخصائص المميزة لمرضى الأورام المختلفة، وبالتالي، قد تتنبأ النتائج الطبية المحتملة للمرضى4. ومع ذلك، فإن توليد نماذج PDX في الفئران يتطلب عينات عالية الجودة من المرضى وأشهر من الوقت لجمع ما يكفي من الخلايا والنماذج للتجارب متعددة المجموعات، والتراكيب الخلوية / الوراثية من xenograft قد الانجراف من تلك الأصلية المريض‘الخزعة. معدل النجاح لإنشاء الفئران PDX نموذج منخفض أيضا، مما يجعل من الصعب أن تنفذ على نطاق واسع في الممارسة السريرية. بالنسبة للمرضى الذين يحملون سرطانات سريعة التقدم مثل سرطان البنكرياس، قد لا تكون قادرة على الحصول على معلومات قيمة من تجارب PDX في الوقت المناسب.
في السنوات القليلة الماضية، وقد أفيد حمار وحشي أن تكون المضيفين المحتملين ليس فقط CDX (خلية المستمدة من الورم xenograft) نماذج، ولكن أيضا نماذج PDX5،6،7،8،9، 10.كالحيوان نموذج الفقاريات، حمار وحشي يأوي أوجه التشابه كافية مع الثدييات في كل من علم الوراثة وعلم وظائف الأعضاء، مع اثنين من المزايا الهامة: الشفافية وصغيرة في الحجم11. حمار وحشي هو أيضا البراز للغاية، ويمكن الحصول على مئات من اليرقات الأصيلة في غضون أيام قليلة من زوج واحد من البالغين12. وقد استخدمت العديد من الدراسات حمار وحشي لتوليد كل من نماذج المعدلة وراثيا وxenograft من أمراض السرطان13،14. بالمقارنة مع الفئران xenografts، حمار وحشي xenografts تسمح تتبع في قرار خلية واحدة. وهناك كمية معينة من الأنسجة البشرية قادرة على توليد مئات من نماذج PDX حمار وحشي (zPDXs)، في حين قد تكون كافية فقط لتوليد زوجين من الفئران نماذج PDX15،16. إلى جانب ذلك، يرقات حمار وحشي في 2-5 dpf بالفعل تطوير أنظمة الدورة الدموية كاملة والأعضاء الأيضية مثل الكبد والكلى، ولكن ليس الجهاز المناعي17، في حين أن كيس صفار المتبقية هي وسيلة 3D الطبيعية، مثالية لفحص المخدرات، والمخدرات اختبارات المقاومة وملاحظاتهجرة الأورام 6،18،19،20،21.
مع محاولة في نهاية المطاف لاستخدام zPDX كمنصة فحص / اختبار للاستخدام السريري، وهنا، ونحن نصف اقتراح الأمثل لنموذج zPDX من سرطان البنكرياس، والذي يسمح في تقييم المخدرات مرشح في الجسم الحي في غضون فترة قصيرة باستخدام خلايا أقل بتكاليف أقل. بالمقارنة مع المراجع السابقةحول zPDX 6،9،10،قدمنا العديد من التحسينات لجعل النظام أكثر جدوى وموثوق بها للتشخيص السريري شخصية: 1) ما قبل الفرز خلية مختلفة المجموعات في أنسجة الورم الأولية وتثبيت الخلايا الأولية لمدة أسبوع واحد قبل إجراء مزيد من التجارب. 2) وضع العلامات على الخلايا البشرية وتعزيز صلاحية الخلية في xenograft عن طريق التعديل الوراثي القائم على فيروس لينتي؛ 3) تحسين حالة ثقافة سمك الحمار الوحشي في كل من المكملات الغذائية (الجلوكوز والجلوتامين) ودرجة الحرارة؛ 4) قياس استجابات المخدرات من أنواع الخلايا المختلفة بطريقة مقارنة. كما قمنا بإجراء تغييرات على حل الحقن عن طريق إضافة العديد من المواد التكميلية. وإجمالا، توفر هذه التحسينات إمكانية توليد بسرعة أكثر من المرضى مثل xenograft في المضيفين حمار وحشي التي يمكن استخدامها كأداة موثوق بها لتقييم استجابة الأدوية المرشحة.
Protocol
Representative Results
Discussion
كل من نماذج PDX وCDX هي منصات حيوية في مجال بيولوجيا الورم22، والخطوة الحاسمة من زرع ناجحة بين الأنواع هو تحسين بقاء xenograft. في الآونة الأخيرة، أظهرت بعض الدراسات أن التعبير العابر من BCL2L1 (BCL-XL) أو BCL2 قد تحسن بشكل كبير من جدوى الخلايا الجذعية الجنينية البشرية في الفئر?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين 81402582، مؤسسة العلوم الطبيعية في شنغهاي 12DZ2295100، 14YF1400600 و 18ZR1404500
Materials
| DMEM | GIBCO | C11995500BT | |
| FBS | Hyclone | sv30087.03 | |
| Y-27632 | Cliniscience | Y0503 | Rho kinase inhibitor |
| Primocin | invivogen | ant-pm-1 | an antibiotic for primary cell cultures |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Nicotinamide | Sigma | N3376 | |
| penicillin streptomycin | GIBCO | 15140122.00 | |
| phosphate buffer (PBS) | GIBCO | C10010500CP | |
| HBSS | GIBCO | 14170112.00 | |
| collagenase type IV | GIBCO | 17104019.00 | |
| hyaluronidase | Sigma | H3884 | |
| DnaseⅠ | Sigma | D5025 | |
| insulin | Sigma | I9278 | |
| b-FGF | GIBCO | PHG0264 | |
| EGF | GIBCO | PHG0314 | |
| pancreatic cancer fibroblasts inhibitor | CHI Scientific | FibrOUT | |
| 0.45 μm sterile filter | Millipore | SLHV033RB | |
| concentration column | Millipore | Millipore UFC910008 | Concentrate the virus |
| polybrene | Sigma | H9268 | |
| Hyaluronic Acid Sodium Salt | Sigma | H7630 | |
| L-glutamine | GIBCO | 21051024.00 | |
| gemcitabine | Gemzan | ||
| methylcellulose | Sigma | M0262 | |
| Navitoclax(ABT-263) | Selleck | S1001 | Bcl-xL inhibitor |
| Equipment | |||
| Microinjector | NARISHIGE | ||
| stereomicroscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Confocal Microscope | LEICA | SP8 | 0.00 |
Referências
- Collins, D. C., Sundar, R., Lim, J. S. J., Yap, T. A. Towards Precision Medicine in the Clinic: From Biomarker Discovery to Novel Therapeutics. Trends in Pharmacological Sciences. 38 (1), 25-40 (2017).
- Huang, L., et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell- and patient-derived tumor organoids. Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).
- Pauli, C., et al. Personalized In Vitro and In Vivo Cancer Models to Guide Precision Medicine. Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The Generation and Application of Patient-Derived Xenograft Model for Cancer Research. Cancer Research and Treatment. 50 (1), 1-10 (2018).
- Fior, R., et al. Single-cell functional and chemosensitive profiling of combinatorial colorectal therapy in zebrafish xenografts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (39), E8234-E8243 (2017).
- Chen, L., et al. A zebrafish xenograft model for studying human cancer stem cells in distant metastasis and therapy response. Methods in Cell Biology. 138, 471-496 (2017).
- Gaudenzi, G., et al. Patient-derived xenograft in zebrafish embryos: a new platform for translational research in neuroendocrine tumors. Endocrine. 57 (2), 214-219 (2017).
- Lee, J. Y., Mazumder, A., Diederich, M. Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts. Journal of Visualized Experiment. (136), (2018).
- Zhang, M., et al. Adipocyte-Derived Lipids Mediate Melanoma Progression via FATP Proteins. Cancer Discovery. 8 (8), 1006-1025 (2018).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews: Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
- Guo, M., et al. U0126 inhibits pancreatic cancer progression via the KRAS signaling pathway in a zebrafish xenotransplantation model. Oncology Reports. 34 (2), 699-706 (2015).
- Yao, Y., et al. Canonical Wnt Signaling Remodels Lipid Metabolism in Zebrafish Hepatocytes following Ras Oncogenic Insult. Pesquisa do Câncer. 78 (19), 5548-5560 (2018).
- Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. Hooking the big one: the potential of zebrafish xenotransplantation to reform cancer drug screening in the genomic era. Disease Models & Mechanisms. 7 (7), 745-754 (2014).
- Zon, L. I., Peterson, R. The new age of chemical screening in zebrafish. Zebrafish. 7 (1), 1 (2010).
- Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Developmental & Comparative Immunology. 28 (1), 9-28 (2004).
- Mercatali, L., et al. Development of a Patient-Derived Xenograft (PDX) of Breast Cancer Bone Metastasis in a Zebrafish Model. International Journal of Molecular Sciences. 17 (8), (2016).
- Wu, J. Q., et al. Patient-derived xenograft in zebrafish embryos: a new platform for translational research in gastric cancer. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 36 (1), 160 (2017).
- Tulotta, C., et al. Imaging Cancer Angiogenesis and Metastasis in a Zebrafish Embryo Model. Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 239-263 (2016).
- Yao, Y., et al. Screening in larval zebrafish reveals tissue-specific distributions of fifteen fluorescent compounds. Disease Model& Mechanisms. , 028811 (2017).
- Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nature Reviews: Clinical Oncology. 9 (6), 338-350 (2012).
- Charo, J., et al. Bcl-2 overexpression enhances tumor-specific T-cell survival. Pesquisa do Câncer. 65 (5), 2001-2008 (2005).
- Wang, X., et al. Human embryonic stem cells contribute to embryonic and extraembryonic lineages in mouse embryos upon inhibition of apoptosis. Cell Research. 28 (1), 126-129 (2018).
- Boise, L. H., et al. bcl-x, a bcl-2-related gene that functions as a dominant regulator of apoptotic cell death. Cell. 74 (4), 597-608 (1993).
- Moore, J. C., et al. Single-cell imaging of normal and malignant cell engraftment into optically clear prkdc-null SCID zebrafish. Journal of Experimental Medicine. 213 (12), 2575-2589 (2016).
