Пациент полученных гетерогенных Xenograft Модель рака поджелудочной железы использованием черыщения зебрав в качестве хозяев для сравнительной оценки наркотиков
Summary
Этот протокол описывает процедуры оптимизации в вирусной двойной флуоресценции помечены опухоли ксенотрансплантат модели с использованием личиночных зебр в качестве хостов. Эта неоднородная модель ксенотрансплантата имитирует состав тканей микроокружения рака поджелудочной железы in vivo и служит более точным инструментом для оценки лекарственных реакций в персонализированных моделях zPDX (зебрафиш пациента, полученных ксенотрансплантатом).
Abstract
Пациент полученных опухоли ксенотрансплантат (PDX) и клеточной опухоли ксенотрансплантата (CDX) являются важными методами для доклинической оценки, лекарства руководства и основных исследований рака. Поколения моделей PDX у традиционных мышей-хозяев отнимают много времени и работают только на небольшую часть образцов. В последнее время зебрафиш PDX (zPDX) стала уникальной системой хоста, с характеристиками мелкомасштабной и высокой эффективности. Здесь мы описываем оптимизированную методологию для создания двойной модели ксенотранспланта опухоли с двойной флуоресценцией для сравнительной химиотерапии в моделях zPDX. Опухолевые клетки и фибробласты обогащались из свежесобранной или замороженной ткани рака поджелудочной железы в различных условиях культуры. Обе группы клеток были помечены лентивирусом, выражающим зеленые или красные флуоресцентные белки, а также антиапоптозным геном BCL2L1. Трансинфицированные клетки были предварительно смешаны и совместно введены в 2 dpf личильных зебры, которые затем были выведены в модифицированной среде E3 при 32 градусах Цельсия. Модели ксенотрансплантата лечились химиотерапевтическими препаратами и/или ингибитором BCL2L1, и одновременно исследовались возможности как опухолевых клеток, так и фибробластов. Таким образом, этот протокол позволяет исследователям быстро генерировать большое количество моделей zPDX с разнородной микросредой опухоли и обеспечивает более длинное окно наблюдения и более точную количественную оценку в оценке эффективности кандидатов на наркотики.
Introduction
Точность онкологии стремится найти наиболее полезные терапевтические стратегии для отдельных пациентов1. В настоящее время, многочисленные доклинические модели, такие как в пробирке первичной культуры, в пробирке органоидной культуры2, и пациента полученных ксенотрансплантатов (PDX) у мышей до или после органоидной культуры предлагаются для диагностики и для проверки / оценки потенциала терапевтический выбор3. Модель PDX, генерируемая инъекцией первичных раковых клеток человека в иммунных мышей, является одним из наиболее перспективных инструментов для персонализированного скрининга наркотиков в клинической онкологии3,4. В отличие от культивируемой клеточной линии in vitro, модели PDX обычно сохраняют целостность и неоднородность опухолевой среды in vivo, лучше имитируя разнообразие и особенности различных опухолевых пациентов, и, следовательно, могут предсказать потенциальный медицинский исход пациентов4. Тем не менее, генерация моделей PDX у мышей требует высококачественных образцов пациентов и месяцев времени, чтобы собрать достаточное количество клеток и моделей для многогрупповых экспериментов, а клеточные/генетические композиции ксенотранспланта могут дрейфовать от исходных биопсии пациента. Уровень успеха для создания мышей PDX модель также низка, что затрудняет широкое внедрение в клинической практике. Для пациентов, перевозящих быстро прогрессирует рака, как рак поджелудочной железы, они не могут быть в состоянии получить ценную информацию из PDX экспериментов во времени.
В последние несколько лет, зебрафиш, как сообщается, потенциальные хозяева не только CDX (клеточная опухоль xenograft) модели, но и МОДЕЛИ PDX5,6,7,8,9, 10. Как позвоночных модели животных, зебра гавани достаточно общего с млекопитающими в генетике и физиологии, с двумя значительными преимуществами: прозрачность и небольшой размер11. Зебрафиш также очень плодовитость, и сотни инбредных личинок могут быть получены в течение нескольких дней из одной пары взрослых12. Несколько исследований использовали зебры для создания трансгенных и ксенотрансплантата модели онкологических заболеваний13,14. По сравнению с мышами ксенотрансплантатов, зебрафиш ксенотрансплантатов позволяют отслеживать в одном разрешении клеток. Определенное количество человеческих тканей способен генерировать сотни моделей зебры PDX (zPDXs), в то время как может быть достаточно только для создания нескольких мышей PDX модели15,16. Кроме того, личинки зебры при 2-5 dpf уже развивают сядочечные системы кровообращения и метаболические органы, такие как печень и почки, но не иммунная система17, в то время как оставшийся желтковый мешок является естественной 3D-средой, идеально подходит для скрининга наркотиков, наркотиков тесты на устойчивостьи наблюдения миграции опухоли 6,18,19,20,21.
С конечной попыткой использовать zPDX в качестве скрининга / тестирования платформы для клинического использования, здесь, мы описываем оптимизированное предложение для zPDX модель рака поджелудочной железы, которая позволяет in vivo кандидат оценки наркотиков в течение короткого времени, используя меньше клеток при меньших затратах. По сравнению с предыдущими ссылками о zPDX6,9,10, мы ввели несколько оптимизаций, чтобы сделать систему более осуществимой и надежной для клинической персонализированной диагностики: 1) предварительной сортировки различных клеток группы в первичных опухолевых тканях и стабилизация первичных клеток в течение одной недели до дальнейших экспериментов; 2) маркировка клеток человека и повышение жизнеспособности клеток в ксенотрансплантате с помощью лентивирусной генетической модификации; 3) оптимизация состояния культуры зебры как в пищевых добавках (глюкоза и глутамин) и температуре; 4) количественная оценка лекарственных реакций различных типов клеток в сравнительной манере. Мы также внесли изменения в инъекционное решение, добавив несколько дополнительных материалов. В целом, эти улучшения дают возможность быстро генерировать более терпеливый ксенотрансвант в хостах зебры, которые могут быть использованы в качестве надежного инструмента для оценки реакции кандидатов наркотиков.
Protocol
Representative Results
Discussion
Оба модели PDX и CDX являются жизненно важными платформами в области биологии опухоли22, и критический шаг успешной межвидовой трансплантации является улучшение выживания ксенотрансплантата. Недавно некоторые исследования показали, что переходное выражение BCL2L1 (BCL-XL…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая 81402582, Фондом естественных наук Шанхая 12D-2295100, 14YF1400600 и 18’1404500
Materials
| DMEM | GIBCO | C11995500BT | |
| FBS | Hyclone | sv30087.03 | |
| Y-27632 | Cliniscience | Y0503 | Rho kinase inhibitor |
| Primocin | invivogen | ant-pm-1 | an antibiotic for primary cell cultures |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Nicotinamide | Sigma | N3376 | |
| penicillin streptomycin | GIBCO | 15140122.00 | |
| phosphate buffer (PBS) | GIBCO | C10010500CP | |
| HBSS | GIBCO | 14170112.00 | |
| collagenase type IV | GIBCO | 17104019.00 | |
| hyaluronidase | Sigma | H3884 | |
| DnaseⅠ | Sigma | D5025 | |
| insulin | Sigma | I9278 | |
| b-FGF | GIBCO | PHG0264 | |
| EGF | GIBCO | PHG0314 | |
| pancreatic cancer fibroblasts inhibitor | CHI Scientific | FibrOUT | |
| 0.45 μm sterile filter | Millipore | SLHV033RB | |
| concentration column | Millipore | Millipore UFC910008 | Concentrate the virus |
| polybrene | Sigma | H9268 | |
| Hyaluronic Acid Sodium Salt | Sigma | H7630 | |
| L-glutamine | GIBCO | 21051024.00 | |
| gemcitabine | Gemzan | ||
| methylcellulose | Sigma | M0262 | |
| Navitoclax(ABT-263) | Selleck | S1001 | Bcl-xL inhibitor |
| Equipment | |||
| Microinjector | NARISHIGE | ||
| stereomicroscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Confocal Microscope | LEICA | SP8 | 0.00 |
Referências
- Collins, D. C., Sundar, R., Lim, J. S. J., Yap, T. A. Towards Precision Medicine in the Clinic: From Biomarker Discovery to Novel Therapeutics. Trends in Pharmacological Sciences. 38 (1), 25-40 (2017).
- Huang, L., et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell- and patient-derived tumor organoids. Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).
- Pauli, C., et al. Personalized In Vitro and In Vivo Cancer Models to Guide Precision Medicine. Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The Generation and Application of Patient-Derived Xenograft Model for Cancer Research. Cancer Research and Treatment. 50 (1), 1-10 (2018).
- Fior, R., et al. Single-cell functional and chemosensitive profiling of combinatorial colorectal therapy in zebrafish xenografts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (39), E8234-E8243 (2017).
- Chen, L., et al. A zebrafish xenograft model for studying human cancer stem cells in distant metastasis and therapy response. Methods in Cell Biology. 138, 471-496 (2017).
- Gaudenzi, G., et al. Patient-derived xenograft in zebrafish embryos: a new platform for translational research in neuroendocrine tumors. Endocrine. 57 (2), 214-219 (2017).
- Lee, J. Y., Mazumder, A., Diederich, M. Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts. Journal of Visualized Experiment. (136), (2018).
- Zhang, M., et al. Adipocyte-Derived Lipids Mediate Melanoma Progression via FATP Proteins. Cancer Discovery. 8 (8), 1006-1025 (2018).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews: Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
- Guo, M., et al. U0126 inhibits pancreatic cancer progression via the KRAS signaling pathway in a zebrafish xenotransplantation model. Oncology Reports. 34 (2), 699-706 (2015).
- Yao, Y., et al. Canonical Wnt Signaling Remodels Lipid Metabolism in Zebrafish Hepatocytes following Ras Oncogenic Insult. Pesquisa do Câncer. 78 (19), 5548-5560 (2018).
- Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. Hooking the big one: the potential of zebrafish xenotransplantation to reform cancer drug screening in the genomic era. Disease Models & Mechanisms. 7 (7), 745-754 (2014).
- Zon, L. I., Peterson, R. The new age of chemical screening in zebrafish. Zebrafish. 7 (1), 1 (2010).
- Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Developmental & Comparative Immunology. 28 (1), 9-28 (2004).
- Mercatali, L., et al. Development of a Patient-Derived Xenograft (PDX) of Breast Cancer Bone Metastasis in a Zebrafish Model. International Journal of Molecular Sciences. 17 (8), (2016).
- Wu, J. Q., et al. Patient-derived xenograft in zebrafish embryos: a new platform for translational research in gastric cancer. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 36 (1), 160 (2017).
- Tulotta, C., et al. Imaging Cancer Angiogenesis and Metastasis in a Zebrafish Embryo Model. Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 239-263 (2016).
- Yao, Y., et al. Screening in larval zebrafish reveals tissue-specific distributions of fifteen fluorescent compounds. Disease Model& Mechanisms. , 028811 (2017).
- Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nature Reviews: Clinical Oncology. 9 (6), 338-350 (2012).
- Charo, J., et al. Bcl-2 overexpression enhances tumor-specific T-cell survival. Pesquisa do Câncer. 65 (5), 2001-2008 (2005).
- Wang, X., et al. Human embryonic stem cells contribute to embryonic and extraembryonic lineages in mouse embryos upon inhibition of apoptosis. Cell Research. 28 (1), 126-129 (2018).
- Boise, L. H., et al. bcl-x, a bcl-2-related gene that functions as a dominant regulator of apoptotic cell death. Cell. 74 (4), 597-608 (1993).
- Moore, J. C., et al. Single-cell imaging of normal and malignant cell engraftment into optically clear prkdc-null SCID zebrafish. Journal of Experimental Medicine. 213 (12), 2575-2589 (2016).
